十点多回去的地铁上，无聊的时光陪着思绪远望窗外；
安静的不可束缚的情怀似乎盯着放在地上的背包也会勾出一副诗的意境，思想里的自在至少丰富了这宁静的时光；
在组氨酸标签蛋白纯化的原理中，知识的空白枯燥了看资料的心情，但不情愿辜负了跟在我身后的时光，搜集资料，开始在脑海里织网，将别人分享的知识编织成一篇新的、有价值的文章，因此生物日记实验室部落在此总结了组氨酸标签蛋白纯化的原理、在纯化时一些细节上的影响因素。愿你也能够踩着自己的时光脚印，踏踏实实的学到一些新的知识。 危机干预
弾孔——不要辜负了跟随你的时光
红领巾小五年规划关键词：His 标签；Ni 2+ ；咪唑基；
填料；平衡缓冲液；结合缓冲液；洗脱缓冲液；
组氨酸标签蛋白纯化的原理
组氨酸（His ）标签蛋白纯化利用基因工程的方法将目的蛋白和亲和纯化的His 标签进行融合，充分利用标签的性质纯化重组蛋白，添加His 小标签不会影响表达蛋白的构象、活性，获得目的蛋白质之后，将分子量较大的标签切除，即组氨酸标签蛋白纯化原理
可进行下一步的目的蛋白检测。
His（组氨酸）标签融合蛋白对Ni2+等金属离子有高选择的特异性，因此，Ni2+等金属离子能够螯合His标签蛋白固定在层析介质上，而其他的杂质蛋白质不能结合或者仅能微弱的结合而被洗脱下来，利
用高浓度的咪唑基能够竞争性的结合Ni离子，洗脱液中含有500 mM的咪唑能够保证目的蛋白完全洗脱，从而获得目标蛋白。
麦麦提依明 努尔麦麦提这种通过亲和纯化组氨酸标签蛋白来实现目的蛋白的纯化的方法是IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)固定化金属离子亲和谱法，是最有效的研究蛋白质结构和功能的方法。目前，利用IDA（亚胺二乙酸）或者NTA（氮川乙酸）作为配基共价结合在固体支持物填料上，螯合过渡金属镍，吸附纯化带6个His标签的蛋白，6个组氨酸标签较小，免疫原性较差，不需要除掉小标签，只要是带组氨酸、氨酸、或者半胱氨酸残基的蛋白都可以被吸附，如果需要，纯化条件可以选择将蛋白变性，然后在柱上复性。
通过咪唑基能够和蛋白质竞争结合Ni柱而洗脱目的蛋白，在平衡缓冲液、样品中加入相同浓度的（结合和洗脱缓冲液）的咪唑基降低宿主细胞蛋白的非特异性结合，防止有组氨酸暴漏在外的宿主细胞结合在柱子上，咪唑的浓度是蛋白依赖性的，应该根据实验确定，一般建议起始浓度为20-40mM，通过脱盐柱能够从蛋白中除去咪唑基。另外，其他的洗脱液，作为咪唑基的替换选择，在PH 值的范围在2.5-7.5之间选择较低的pH值，pH值在4以下时，金属Ni离子能够从柱材上剥离，在洗脱缓冲液中降低pH值能够洗脱咪唑基不能吸附的杂带。
多媒体网络教学系统组氨酸标签蛋白纯化注意事项：
（1）在组氨酸标签蛋白纯化时，Ni2+离子是纯化组氨酸标签蛋白的首选金属离子；
（2）选择载量高特异性强的填料。填料一般选择Ni-NTA Sepharose High Perfomance和Ni-NTA Sepharose 6 Fast Flow，由高度交联的琼脂糖凝胶和固定化螯合基团组成，介质可耐受和兼容通常使用的水溶性缓冲液、20 mM的巯基乙醇、10 mM的DTT、8 M的尿素和6 M的盐酸胍等其他蛋白纯化所需要的缓冲液。
（3）通常带组氨酸的标签蛋白在天然状况下被镍琼脂糖凝胶吸附，如果标签折叠在蛋白内部，加入1-2 M的脲素，能够使蛋白质的结构松散但不变性，但对于包涵体蛋白，选择6 M的盐酸胍或者8 M尿素溶解蛋白样品，打开蛋白质使标签暴露，2 mM的DTT可以破坏二硫键而使蛋白质变性。变性后的蛋白可以在变性剂存在的情况下进行纯化；
（4）当金属离子和蛋白的结合力较弱时，不能使用含氮原子的Tris-Hcl缓冲液，经常使用磷酸盐缓冲液，并提高缓冲液的pH值到中性或者弱碱条件下，能够增加蛋白的吸附效果。
（5）在结合缓冲液中加入0.5-1 M 的Nacl能够消除离子交换效应，降低电荷的干扰；
（6）加入吐温能够降低蛋白质间的疏水作用导致的非特异性吸附；
战场后记：
每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论支持，我们是北京义翘神州生物，有专业的蛋白表达纯化团队，若有需要请联系我（***************************）。
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