2010年02月27日星期六09:02
丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达
团结湖三中
1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。 3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。 4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图1
1:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后
二、表达的情况，是可溶还是沉淀
1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下
功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA 出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）
4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，
加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图2
1:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀
三、探索可溶表达条件
有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG浓度，摇床转速等等，所以设定在低IPTG浓度下（0.1mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：
1）37℃250rpm5h
2）30℃180rpm10h
出草3）23℃90rpm30h
改性沥青混合料
过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL液体LB中，37℃，250rp
m，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。从60mL培养液中取10mL 作为未诱导对照，标记3个50mL LB培养菌液：1、37℃250rpm5h2、30℃180rpm10h3、23℃90rpm30h
都分5次取样：
37℃每一小时取样一次（取10mL）编号为：371、372、373、374、375
30℃每二小时取样一次（取10mL）编号为：301、302、303、304、305
37℃每五小时取样一次（取10mL）编号为：231、232、233、234、235
诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE检测：
1、37℃M12345五个样的上清和沉淀
2、30℃M12345五个样的上清和沉淀
3、23℃M12345五个样的上清和沉淀
4、以不同温度下的最优可溶表达做比较
结果如下：
图3：37℃条件下五个样的上清和沉淀
一塌糊涂bbs1:371上清，2:371沉淀，3:372上清，4:372沉淀，5:373上清，6:373沉淀，7:374上清，8:374沉淀，9:375上清，10:375沉淀
图4图4：30℃条件下五个样的上清和沉淀
1:301上清，2:301沉淀，3:302上清，4:302沉淀，5:303上清，6:303沉淀，7:304上清，8:304沉淀，9:305上清，10:305沉淀
图5：23℃条件下五个样的上清和沉淀
1:231上清，2:231沉淀，3:232上清，4:232沉淀，5:233上清，6:233沉淀，
7:234上清，8:234沉淀，9:235上清，10:235沉淀
图6：不同温度下的最优可溶表达
1:234上清，2:234沉淀，3:303上清，4:303沉淀，5:373上清，6:373沉淀，
由图5可知：23℃条件下，明显的提高了上清目的蛋白的含量，并且，存在可溶表达平衡，即20个小
时后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即不论如何改变条件，可溶表达已经达到极限。所以无需探索更低温度等条件。(个人观点，不知道是否正确)
四、大量制备，表达与纯化
配置1L LB液体培养基，分装成100mL×10瓶，分瓶以利于大肠杆菌生长和后续操作。
诱导培养：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL×5管液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL×10瓶液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为0.1mmol/L，23℃，90rpm条件下，继续振荡培养20小时。
破菌收集上清：分别离心（4℃，12000g，5min）加8mL×10管PBS（pH7.0）缓冲液重悬后，冰浴条件下超声波破碎（400W，15s，45s，30min），分别离心（4℃，12000g，15min）收集上清（8mL左右×10管）。
稀释过滤上清：将8mL左右×10管菌液用PBS（pH7.0）缓冲液稀释为2倍，并过0.45纳米滤膜。取1mL留样。
过镍柱纯化：（8mL左右×10管×2倍=160mL，分2次过柱，每次80mL）
中航工业航宇救生装备有限公司A、用缓冲液I（PBS pH7.0缓冲液）平衡镍柱，5个床体积，流速为2mL/min。
B、将稀释过滤后的上清上样，流速为1mL/min。
C、用缓冲液I（PBS pH7.0缓冲液）再洗5个床体积，流速为2mL/min。使目标蛋白充分挂柱。
D、用含50mM咪唑的缓冲液III，洗去杂蛋白，流速为2mL/min。并收集洗杂峰。
E、用含100mM咪唑的缓冲液III，进行洗脱，流速为1mL/min。并收集洗脱峰，收集洗脱液。
电厂节能减排F、将收集的洗脱液用15mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管1.5mL，取1mL4℃备用，其余-80℃保存。
G、各取1mL过柱前、挂柱穿透、洗杂液、洗脱液加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE 检测。
结果如下：
图7蛋白质过Ni柱电泳图示
1:pET-32aA3诱导全菌，2:pET-32aA3诱导沉淀，3:pET-32aA3诱导上清，4:Ni柱穿透，5:50mM咪唑洗杂蛋白，6:Ni柱洗脱（纯化的蛋白），7：超滤离心管浓缩的蛋白
全图：
1:pET-32a未诱导，2:pET-32a诱导，3:pET-32aA3未诱导4:pET-32aA3诱导，
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