一、试剂配制
1、基础液
Na2HPO4 58mmol/L
NaH2PO4 17mmol/L
NaCl 68mmol/L，
每100ml需要2.076g Na2HPO4.12H20，0.265g NaH2PO4，0.4012gNacl，48.048g尿素 2、Wash buffer:
Na2HPO4 58mmol/L
NaH2PO4 17mmol/L
NaCl 68mmol/L
咪唑10mmol/L
3、0,1M NiSO4（50ml）
1.31425g NiSO4定容至50ml
4、Elution buffer:
Na2HPO4 58mmol/L
NaH2PO4 17mmol/L
NaCl 68mmol/L
咪唑在基础液的基础上浓度需要梯度设计50、100、150、250 mmol/L浓度的咪唑5、1M咪唑储备液 0.68g咪唑加蒸馏水定容至10ml
6、溶菌酶（10mg/ml）
10mg溶菌酶溶于1ml 10mmol/L的Tris（PH8.0），每100ul分装于小EP管，用完一支丢弃7、DNase I（1mg/ml）
用1ml下述溶液溶解2mg粗制DNase I
10mmol/L Tris（PH7.5），150mmol/L Nacl，1mmol/L Mgcl2
当DNase I溶解后加入1ml甘油，颠倒混匀，分装后保存于-20℃
8、RNaseA
2ml TE（PH7.6）溶解2mg RnaseA
9、IPTG （1mol/L）速度生活
8ml 蒸馏水加2.38g IPTG，定容至10ml。用0.22um 除菌滤器，分装成1ml 小份贮存于-20℃。
一、蛋白的诱导表达
挑测序正确的BL21大肠杆菌菌液，摇菌至饱和期，取100ul加入10ml含抗生素的LB 液，摇菌至ODA600为0.5-0.6时，加入IPTG（贮存浓度为1M），使终浓度为1mmol，36℃诱导表达4h，（注意：诱导表达的时间、温度以及IPTG的使用浓度需要自己摸索条件）4℃，5000g离心15min收集菌液（至冰盒内）。
傅汉思
二、制备细胞抽提物（包涵体蛋白）
1.10ml表达细胞培养物于预先称重的离心管中4℃5000g离心15min。
2.吸去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入3ml细胞裂解缓冲液I（破包涵
体基础液），轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。
3.每克（湿重）菌体加入4ul 100mmol/L PMSF，80ul 10mg/ml溶菌酶，搅动20min
4.每克菌体加入4mg脱氧胆酸，继续搅动。
5.悬液37℃放置，不时用磨光玻璃棒搅动，待其变粘时每克（湿重）菌体加入20ul1mg/ml
DNase I。
6.裂解液室温放置，直至不再粘稠。（0.5-1h）
三、包涵体的洗涤
破包涵体基础液配制
50mM /L Tris-Hcl
1mM /L EDTA
100mM /L Nacl Hcl调PH到8.0 即1L加6.057g Tris，0.37224g EDTA。
1.包涵体洗涤
A液： 2M尿素（破包涵体基础液溶解）+TritonX-100（0.5%-1%）【A液50ml：需要尿素6.006g ＋TritonX-100 0.25ml】
B液： 4M尿素（破包涵体基础液溶解）不加TritonX-100（0.5%-1%）【B液50ml：需要尿素12.012g】
（TritonX-100的作用为去除大肠杆菌的杂蛋白）
以下为冰盒上操作：(此为1500ml菌液用量)沉淀先用破包涵体基础液洗两遍，再加A 液10ml重悬，4℃3A-17转子，12000rpm，15min，弃上清，洗涤两次；然后用B液洗涤一次，6000rpm，15min。（注：A液和B液洗涤后均要留上清和沉淀，用于SDS-PAGE）
四、包涵体的溶解
洗涤后包涵体沉淀加入8M的尿素，溶于基础液中（Na2HPO4 58mmol/L，NaH2PO4 17mmol/L，NaCl 68mmol/L）18ml，放1h，沉淀即完全溶解，溶液澄清透亮。
五、Ni离子柱的准备
1、首次使用，取1ml树脂，短暂离心后加入1ml 0.1mol/L的NiSO
4
谱图反复混匀，短暂离心
2、倒掉上清，再次加入NiSO
4
洗涤树脂，反复2-3次，可见树脂变为天蓝即可。反复使用。
3、若树脂已经在柱子上了，首先看树脂是否已经沉淀到管底，若已经沉淀好，放开下
面的开口，然后加蒸馏水多洗几遍，使流水冲洗，不得使柱子干涸，保持一直有液
体状态；然后堵上柱子开口，用NiSO
4混匀柱子上的树脂，待沉淀后再加NiSO
4
洗一
遍，共洗三遍，可见树脂变为天蓝即可。
六、上样
1、待树脂沉降后用三倍体积的无菌水冲洗树脂
2、用三倍基础液平衡树脂
3、上样，将溶解后的蛋白溶液反复上样2-3次，用干净EP管收集。
4、用Wash Buffer洗柱子，3倍体积
5、首次做用不同浓度的Elution buffer 洗脱目的蛋白
6、用Wash buffer洗柱子2-3次
7、剥离液洗柱子，大约用2-3倍体积
剥离液配制：
O 0.1211g Tris（PH8.0）
50ml剥离液含有1.461gNacl，1.8612g EDTA.2Na.2H
2
8、去离子水洗2-3遍，然后20%乙醇保存柱子，存于4℃（用不同浓度的Elution buffer
洗柱子后均要用EP管收集，每一管可能洗脱下的量都不一样，故做好标记，上
SDS-PAGE观察结果）
（由于是包涵体，所以在上样步骤中各种试剂都要加8M尿素，包括基础液也是含8M尿素的）伯克纳
1、常用透析袋截留分子质量在12000-14000Da之间较合适，可用于透析大多数质粒DNA和许多蛋白。
2、将透析管剪成适当长度，10-20cm的小段
3、在大体积的2%（m/v）NaHCO3 {（MW:84）20g→1L}和1mmol/L EDTA(pH8.0)中将透
析袋煮沸10min。
4、将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。
5、将透析袋置1mmol/L EDTA (pH8.0)中煮沸10min。{0.37224g→1L}
6、将透析袋冷却，存放于4℃，应确保透析袋始终浸没在液体中。（注意：从此步
起用透析袋一定要戴手套）
八、复性
透析法，逐步降低尿素浓度，从8M到4M到2M到TGE（加20%甘油）溶液(万金油)
1、用万金油配4M尿素+2g甘氨酸+5g精氨酸、2M尿素+2g甘氨酸+5g精氨酸
2、将透析袋中装入所需蛋白溶液，两头用夹子固定夹紧
3、将透析袋放入含4M尿素的万金油中，4℃磁力搅拌器透析12h，12h后加入等
体积的不含尿素的万金油，使透析液浓度变为2M尿素，此时注意把那个将转子速度减低。观察透析袋中有无沉淀产生
4、在2M尿素透析12h后将透析袋放入万金油中，继续透析12h。继续观察透析
袋中有无沉淀产生
5、若透析袋中无沉淀产生，透析结束后将透析袋放于蔗糖上，吸收透析袋内多
余水分，使上清内蛋白浓度增高，12000g，4℃离心10min取上清跑SDS-PAGE 胶看透析后的结果。
九、黄金buffer透析法（万金油）
a)黄金buffer配方：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
pcchips
5%或10％甘油
1％的甘氨酸
（配500ml的buffer需要：
3.0285g Tris
0.09306g EDTA
1.461g Nacl
50ml 甘油
5g 甘氨酸
大约需要100ml 0.1M 的稀盐酸调节PH至8.0，最后定容至500ml）
b)将洗脱后的Elution buffer 溶液放入透析袋，加入200-300ml buffer
后透析8h换液一次，连续透析三次，观察有无沉淀产生。透析结束后透析袋放于蔗糖上，吸收透析袋
内多余水分，使上清内蛋白浓度增高，12000g，4℃离心10min取上清跑SDS-PAGE 胶看透析后蛋白浓度
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