铜绿假单胞菌注射液对肺癌A549细胞自噬及P7K/Akt 通路的影响 赵智董仁松
【摘要】目的 探究铜绿假单胞菌注射液(PA-MSHA )对肺癌A549细胞自噬及磷脂酰肌醇P 激酶
(PI3K )/蛋白激酶B (Akt )通路的影响。方法 体外培养人肺癌A549细胞，随机分为空白对照组、LY294002 组(加入 20 $ mol/L LY294002 ) , PA-MSHA 干预组(加入 0.5 x 109/mL 、1.0 x 109/mL 、2.0 x 109/mL PA-
MSHA ) $干预培养48 h 后,MTT 法检测各组细胞活性，平板克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，透射电子 显微镜观察各组细胞自噬情况,Western blot 检测各组细胞中自噬相关蛋白p62、LC3 I 、LC3 .
及PFK/Akt 通
路相关蛋白PI3K 、Akt 、pPFK 、pPkt 表达。结果 与空白对照组相比,LY294002组、0. 5 x 109/mL 、1. 0 x 109/
mL 、2.0x109/mLPA-MSHA 组细胞增殖抑制率、LC3 ./LC3 I
蛋白表达显著升高(P < 0. 05 "，自噬体个数增
力II，细胞克隆形成率、p62、pPFK/PFK 、pPkOAkt 蛋白表达显著降低(P <0. 05)；与LY294002组相比,0. 5 x
109/mL 、1. 0x 109/mL PA-MSHA 组细胞增殖抑制率、LC3 . /LC3 I
蛋白表达显著降低(P <0. 05)，自噬体个数
减少，细胞克隆形成率、p62、pPFK/PFK 、p-KkOAkt 蛋白表达显著升高(P < 0. 05 )；与0. 5 x 109/mL 、1. 0 x
109/mL PA-MSHA 组相比,2. 0 x 109/mL PA-MSHA 组细胞增殖抑制率、LC3 . /LC3 I
蛋白表达显著升高！ P<
0. 05)，自噬体个数增加，细胞克隆形成率、p62、pPFK/PFK 、pPkOAkt 蛋白表达显著降低(P<0. 05 )$结论
PA-MSHA 可能通过调控PFK/Akt 信号通路，促进肺癌A549细胞自噬，抑制细胞增殖。
doi : 10. 3969/j. ion. 1009 - 6663.2021.02.021
作者单位*050000河北石家庄，河北医科大学第二医院药学部
【关键词】铜绿假单胞菌；肺癌；自噬；磷脂酰肌醇聚激酶/蛋白激酶B 通路
Effect of Pseedomonat aeruginosa injection on autophagy and PI3K/Akt pathway of lung cancer A549 cells
ZHAO Zhi , DONG Ree-song
Pharmacy Deparhnent , the Second Hospital o Hebei Medical Universita , Shijiazhuang , Hebei 050000, China
(Abstract ) Objective Tv investigte the efect of Pseudomonas aeruginosa injection ( PA-MSHA ) on autv-
phag and phosphaVdylinosi/l-C kinase ( PFK)/protein kinase B ( Akt ) pathway in lung cancer A549 cells. Meth
ods Human lung cancer A549 cells were cultured in vitro and randomly divided into the blank control group , the LY294002 group ( added 20 $
mT/L LY294002 ) , and the PA-MSHA inOoention group ( added 0. 5 x 109/mL , 1. 0
x 109/mL , 2. 0 x 109/mL PA-MSHA ) . After 48 hours T culture inOvention , MTT method wasused todetectthe
ceiactieityoeeach geoup , theeipeeimentoepiatecioneeoemation wasused todetecttheceipeoiieeeation abiiityoe each geoup , teansmision eiecteon miceoscopewasused toobseeeetheautophagy , and Westeen biotwasused todetect
the expressions of autophagy related proteins p62, LC3 I , LC3
. and PFK/Akt pathway related proteins PFK ,
Akt , p-PI3K and p-Akt. Results Compared with the blank control group , the inhibition rate of cell poliferafon and the expression T LC3 ./LC3
I protein in the LY294002 group , and the 0. 5 x 109/mL , 1. 0 x 109/mL and 2. 0 x
109/mL PA-MSHA groups were significanOy higher (P <0. 05), the number of autophagy were higher , and the rate or cell clone formation , the expressions of p62, p-PFK/PFK, p-KkOAkt proteins were significantly lower ( P <
0. 05 ) . Compared with the LY294002 group , the inhibition rate of cell proliferation and the expression of LC3 . /LC3
中国商检局I protein in the 0. 5 x 109/mL and 1. 0 x 109/mL PA-MSHA groups were significantly lower ( P < 0. 05 ), the num
ber of autophagy were lower , and the rate of cell clone formation , the expressions of p62, p-PFK/PFK , p-Kkt/Akt
中国青年运动的时代主题proteins were significan/y higher ( P < 0. 05 ). Compared with the 0. 5 x 109/mL and 1. 0 x 109/mL PA-MSHA
groups , the inhibition rate of cell proliferation and the expression of LC3 . /LC3 I protein in the 2. 0 x 109/mL PA-
MSHAgeoup weeesigniicantiyhighee ( P <0.05) , thenumbeeoIautophagyweeehighee , and theeat
eoIceicione
formafon , the expressions of p62, p-PFK/PFK , p-KkOAkt proteins were significan/y lower (P <0. 05) . Conclu
sion PA-MSHA may promote autophag and inhibit cell proliferation of lung cancer A549 cells by reyulafng PFK/
Akt signaling pathway.
(Key words]Pseudomonas aeruginosa；lung cancer；autophagy；phosphatidylinositol A kinase/protein kinase Bpaihway
随着社会的发展，环境和生活方式的不断改变，肺癌的发病率逐年上升，严重危害人们的生命健康［1-2］$自噬是细胞的一种程序性死亡方式，目前大量研究显示，自噬在肿瘤的发生发展和临床诊治中起着重要作用［3-5］，通过影响鼻咽癌细胞自噬行为可以增强其对放疗的敏感性［6］$磷脂酰肌醇A 激酶（phosphf i dy/nosimlA kinasa,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinasa B,Akl）信号通路与肿瘤发生、发展密切相关，通过抑制PQK/AKT/mTOR信号通路的活性，抑制肺癌细胞增殖，诱导细胞自噬和凋亡切，通过对PI3K/AKT信号通路的研究，可以有效到肺癌临床预防和的新药物。铜绿假单胞
菌注射液（pseudomonas awaginwa,PA-MSHA）可用于癌症的临床，研究显示PA-MSHA可以抑制肺癌细胞增殖并促进其凋亡［8］，然而关于PA-MSHA对肺癌细胞自噬的影响及其作用机制研究报道较少。本研究通过观察PA-MSHA对肺癌A549细胞增殖、自噬的影响，探讨其可能的作用机制，为肺癌的临床诊治提供一定理论基础。
资料与方法
一、主要试剂及仪器
DMEM培养基（货号*31600034）购自美国Giber公司；LY294002（货号：PHZ1144）购自中国赛默飞世尔公司；PA-MSHA（国药准字S2*******）购自北京万特尔生物制药有限公司；MTT试剂盒（货号: GM01-500T）购自上海歌凡生物科技有限公司;PI3K 抗体（货号:ab32089）、AKT抗体（货号:ab38449）、p-AKT抗体（货号：ab8805）、p62抗体（货号：91526）、微管相关蛋白1轻链3（mdrotubuie-associ-ated protein1light chain3,LC3）抗体（货号：ab51520）购自abeam公司；p-PI3K抗体（货号：ki-6417R）购自中国康朗生物公司；辣根过氧化物酶标记的二抗（货号:BHR101）购自北京博尔西科技有限公司；蛋白电泳及电转移装置（型号:AU5800）购自北京市六一仪器厂；C02培养箱（型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC）购自日本松下公司；酶联免疫分析仪（型号:EVO75）购自澳大利亚Techan公司；超低温冰箱（型号：MDF-U32V）购自美国Thermo公司；通过透射电子显微镜（型号：H7650）购自日本日立有限公司。
二、实验方法
1细胞培养及分组
A549细胞由上海中科院细胞库提供$将A549细胞在含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基中培养，将其置于37T、5%CO2恒温培养箱中，培养12h后，用显微镜观察细胞生长状态，当细胞完全汇合时，进行消化传代。传代3次后，取对数生长期细胞，随机分为空白对照组、LY294002组、PA-MSHA干预组，LY294002组：用20$mol/L LY294002进行干预处理;PA-MSHA干预组：分别加入0.5x109/mL、1.0x109/mL、2.0x109/m-PA-MSHA进行干预处理；空白对照组：不做任何处理。
2MTT法检测各组细胞活性
收集对数生长期的各组A549细胞，调整细胞浓度为1x105个/mL接种于96孔板中，每组6个平行,37T、5%CO2恒温培养箱中培养48h后，每孔入20$L MTT（浓度为5mg/mL）,37°C培养4h，加150$L二甲基亚矶，低速震荡至溶解，用酶标仪在波长570nm下测定吸光度（A值），实验重复6次，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-A实验组/A对照组）x100%$
3平板克隆形成实验检测各组细胞增殖能力
收集对数生长期的各组A549细胞，调整浓度为1x103个/mL接种至培养皿中，当克隆细胞肉眼可见时，
弃去培养基，用结晶紫染、冲洗、晾干后，相机拍照并计数。各组设置6个平行，实验重复6次。细胞克隆形成率=克隆形成数/接种细胞数x 100%$
4透射电子显微镜观察各组细胞自噬情况
收集对数生长期的各组A549细胞，用戊二醛固定过夜,1%饿酸固定、脱水，细胞用Epon浸渍，超用酰和染，透射电显巴尔蒂斯
镜观察$
5Western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达
提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整各组上样蛋白总量为30ug，进行凝胶电泳分离后,
转膜，封闭后孵育一抗(p62、LC3%PI3K、Akt%p-PI3K、pAkt、2内ok抗体,1:1000),4C孵育过夜，次入二抗(1：5000)室育2h,，化学发光(ECL)液进行显影，定影后用Imaga J图像分 析软件进行半定量分析，以2内eta为内参，计算各白相对表达量。
三、统计学方法
本研究所得数据均采用SPSS22.0软件进行统计，计量资料以平均数土标准差(u±s)表示，多组间比较采用方差分析，进一步比较采用SNK-a检验。P<0.05为差异有统计学意义$
结果
一、PA-MSHA对A549细胞增殖抑制率的影响
与空白对照组相比，LY294002组、0.5x109/ mL、1.0x10"7mL、2.0x109/m-PA-MSHA组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)；与LY294002组比,0.5x109/mL、1.0x109/m-PA-MSHA组细胞增殖抑制率显著降低(P<0.05)；与0.5x109/mL、1.0x109/m-PA-MSHA组相比,2.0x109/m-PA-MSHA组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)(见表1)$
表1PA-MSHA对A549细胞增殖抑制率的影响(u±s)
组别n殖抑率(%)
空白对组60.00±0.00
LY294002组645.08±3.50a
0.5x109/mL PA-MSHA组628.91±2.84a b
1.0x109/mL PA-MSHA组630.56±
2.91a
2.0x109/mL PA-MSHA组644.89±
3.76acd
F-235.994
P-<0.001注：与空白对照组相比，a P<0.05；与LY294002组相比，b P< 0.05；与0.5x109/mL PA-MSHA组相比，©P<0.05；与1.0x109/mL PA-MSHA组相比，d P<0.05$
二、PA-MSHA对A549细胞克隆形成能力的影响
与空白对照组相比，LY294002组、0.5x109/ mL、1.0x10"7mL、2.0x109/m-PA-MSHA组细胞克隆形成率显著降低(P<0.05)；与LY294002组比,0.5x109/mL、1.0x109/m-PA-MSHA组细胞克隆率显著升高(P<0.05)；与0.5x109/mL、1.0x109/m-PA-MSHA组相比,2.0x109/m-PA-MSHA组细胞克隆形成率显著降低(P<0.05)(见图1、表2）$
图1PA-MSHA对A549细胞克隆形成能力的影响（x10）
A：空白对照组；B：LY294002组；C：0.5x109/mL PA-MSHA组; D：1.0x109/mL PA-MSHA组；E：2.0x109/mL PA-MSHA组
表2PA-MSHA对A549细胞克隆形成率的影响(U±i
组别n隆率(%)空白对组699.36±5.12
LY294002组634.12±2.03c
0.5x109/mL PA-MSHA组662.68±5.42a b
1.0x109/mL PA-MSHA组660.03±3.34a b
2.0x109/mL PA-MSHA组636.67±
3.15co
F-256.245
P-<0.001注：与空白对照组相比，a P<0.05；与LY294002组相比，b P< 0.05；与0.5x109/mL PA-MSHA组相比,©P<0.05；与1.0x109/mL PA-MSHA组相比,d P<0.05$
三、PA-MSHA对A549细胞自噬的影响
与空白对照组相比，LY294002组、0.5x109/ mL、1.0x10"7mL、2.0x109/m-PA-MSHA组细胞自噬体个数增加；与LY294002组相比,0.5x109/ mL、1.0x109/m-PA-MSHA组细胞自噬体个数减少；与0.5x10"7mL、1.0x109/m-PA-MSHA组相比,2.0x109/m-PA-MSHA组细胞自噬体个数增加(见图2)$
、PA-MSHA对A549细胞自噬相关蛋白p62、LC3I、LC3n表达的影响
与空白对照组相比，LY294002组、0.5x109/ mL、1.0x10"7mL、2.0x109/m-PA-MSHA组细胞p62蛋白表达显著降低(P<0.05)丄C3II/CC3I蛋白表达显著升高(P<0.05)；与LY294002组相比,
破茧狂龙
0.5x109/mL、1.0x109/mL PA-MSHA组细胞p62蛋白表达显著升高(P<0.05),LC3n/LC3I蛋白 表达显著降低(P<0-05)；与0.5x109/mL、1.0x 109/mL PA-MSHA组相比,2.0x109/mL PA-MSHA 组细胞p62蛋白表达显著降低（P<0-05）,LC3./ LC3I白表达显著升高（P<0.05）（见图3、表3）$
阻尼线
图2各组A549细胞透射电子显微镜图(x8400)
A：空白对照组；B:LY294002组；C：0,5x109/mL PA-MSHA^；D:1.0x109/mL PA-MSHA^；E:2.0x109/mL PA-MSHA组
图3各组A549细胞p62、LC3I、LC3-蛋白表达图
A：空白对照组；B:LY294002组；C：0,5x109/mL PA-MSHA组；D：1.0x109/mL PA-MSHA组；E：2.0x109/mL PA-MSHA组
表3PA-MSHA对A549细胞自噬相关蛋白p62、LC3I、LC3-
表达的影响！t±0
组别n p62/0-actin LC3./LC3I
空白对组60.86±0.040.78±0.02 LY294002组60.63±0.03a 1.13±0.03a
0.5x109/mL PA-MSHA组60.75±0.02a b0.86±0.04a b
1.0x109/mL PA-MSHA组60.73±0.04a b0.87±0.03d
2.0x109/mL PA-MSHA组60.64±0.05aT 1.12±0.02fd F一37.586186.929
P—<0.001<0.001注：与空白对照组相比，a P<0.05；与LY294002组相比，b P< 0.05；与0.5x109/mL PA-MSHA组相比,°P<0.05；与1.0x109/mL PA-MSHA组相比，d P<0.05o
五、PA-MSHA对A549细胞PFK/AKT信号通路相关蛋白PFK、AkopPFK、pPkt表达的
与空白对照组相比，LY294002组、0.5x109/ mL、1.0x109/mL、2.0x109/mL PA-MSHA组细胞pPP3K/PFK、p-KkOAkt蛋白表达显著降低(P< 0.05)；与LY294002组相比，0.5x109/mL、1.0x 109/mL PA-MSHA组细胞p-PFK/PFK、p-Kkt/Akt 蛋白表达显著升高(P<0.05)；与0.5x109/mL、1.0x109/mL PA-MSHA组相比,2.0x109/mL PA-MSHA组细胞p-PFK/PFK、p-Kkt/Akt蛋白表达显著降低(P<0-05)(见图4、表4)。
图4各组A549细胞PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达图
A：空白对照组；B：LY294002组；C：0,5x109/mL PA-MSHA组；D：1.0x109/mL PA-MSHA组；E：2.0x109/mL PA-MSHA组
表4PA-MSHA对A549细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、AkS、p-PI3K、p-Akt表达的影响！咒±0
组别n p-PFK/PFK p-AkOAkt
空白对组60.95±0.030.90±0.02 LY294002组60.68±0.03a0.74±0.03a
0.5x109/mL PA-MSHA组60.84±0.02a b0.83±0.04a b
1.0x109/mL PA-MSHA组60.86±0.04a b0.82±0.04a b
2.0x109/mL PA-MSHA组60.70±0.03aT0.76±0.02s F一82.85124.490
P一<0.001<0.001注：与空白对照组相比，a P<0.05；与LY294002组相比，b P< 0.05；与0.5x109/mL PA-MSHA组相比,°P<0.05；与1.0x109/mL PA-MSHA组相比，d P<0.05
o
讨论
肺癌是肿瘤疾病中发病率较高的疾病，是导致癌症死亡率上升的主要原因，目前临床肺癌手段主要以手术为主，化疗为辅，随着医疗水平的不断发展和对肺癌分子水平的研究，肺癌患者的生存率已有所提高PA-MSHA是通过基因工程开发的一种生物制剂，广泛用于多种肿瘤的辅助，王光林等［10］研究显示，PA-MSHA结直肠癌恶性腹腔积液能取得较好的近期疗效，并能改善患者生活质量，且疗效优于顺钳$Zhang等［11］研究显示，PA-MSHA可以改善细胞因子诱导的杀伤细胞的功能，可有效恶性肿瘤。Zhao等-12.研究显示，PA-MSHA可以抑制非小细胞肺癌细胞增殖，诱导其凋亡。本研究发现，与空白对照组相比，PA-MSHA 干预处理组细胞增殖抑制率显著升高，细胞克隆形成率显著降低，且2.0x109/mL PA-MSHA组较0.5 x109/mL、1.0x109/m-PA-MSHA组细胞增殖抑制率显著升高，细胞克隆形成率显著降低，提示PA-MSHA可以抑制肺癌A549细胞增殖且呈剂量依赖$自噬是一种分解代谢过程，在维持细胞内稳态中发挥重要作用，可保护细胞和生物体免受应激源的侵害，自噬不仅维持细胞的正常生理，在癌症的病理过程中也起核心作用［13'14］$Ravanan等［15］研究显示，抑制自噬有助于癌症。Xu等［16］研究显示，PA-MSHA可激噬$本研究发现，与空白对照组相比,PA-MSHA干预组细胞自噬体个数增加，且2.0x109/m-PA-MSHA组较0.5x 109/mL、1.0x109/m-PA-MSHA组细胞自噬体个数增加，提示PA-MSHA可以促进A549细胞自噬且呈剂量依赖$LC3是一种自噬标记蛋白,p62是细胞自噬受体蛋白，在自噬过程中丄C3L I是反映细胞自噬
活性的关键指示蛋白。在自噬过程中被自噬体降解,p62蛋白表达与自噬活性成反比，可以间接反映自噬活性［17］$因此，通过免疫印迹检测LC3和p62表达以反映自噬水平。本研究发现，与空白对照组相比,PA-MSHA干预组细胞p62蛋白表达显著降低,LC3I/CC3I蛋白表达显著升高，呈剂量依赖，与方彪彪等［18］研究结果一致，提示PA-MSHA可以通过调节自噬相关蛋白p62、LC3I、LC3I表达，促进肺癌A549细胞自噬。
PI3K/Akt信号通路是哺乳动物细胞处于肿瘤抑制、氧化应激、感染等条件时调节自噬的主要途径。Xua等问研究显示，抑制PI3K/Akt/mTOR 信号传导途径可以诱导胰腺癌细胞自噬。本研究发现，与空白对照组相比，PA-MSHA干预组细胞p-PI3K/PI3K、p干kt/Akt蛋白表达显著降低，且呈剂量依赖，提示在肺癌A549细胞中PA-MSHA可以抑制PI3K、Akt磷酸化蛋白表达，推测PA-MSHA可能通过抑制PQK/Akt通路激活，调节自噬相关蛋白表达，促进A549细胞自噬。LY294002是PI3K/Akt信号通路抑制剂，伍宏山等［20］研究显示，LY294002通过抑制PQK/Akt信号通路降低人A549细胞的自噬活性、增殖、迁徙和侵袭。本研究发现,2.0x109/ mLPA-MSHA组与LY294002组殖抑率、细胞克隆形成率、细胞自噬体个数、p62、LC3I/CC3 I、p-PI3K/PI3K、pLki/Akt蛋白表达均无显著性差异，提示2.0x109/m-PA-MSHA与LY294002在肺癌细胞中作用效果一致，进一步提示PA-MSHA对肺癌A549细胞活性、自噬的影响，可能是通过调控PQK/Akt通路实现的。
综上所述，PA-MSHA可能通过调控PQK/Akt 通路抑制PQK、Akt磷酸化，调节自噬相关蛋白p62、LC
3I、LC3I表达，促进肺癌A549细胞自噬，抑制细胞增殖，但PA-MSHA对肺癌细胞自噬的具体作用机制及其是否具有临床作用仍需进一步验证。
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