萝卜硫素
赵起越;赵红帅;刘保献;徐蘇士
【摘 要】蓝藻水华会向地表水中排放大量的微囊藻毒素,对水生动、植物及人类构成很大威胁.综述了国内外分析微囊藻毒素的方法,包括生物检测法、生物化学检测法、化学仪器检测法等,指出了地表水中微囊藻毒素检测分析方法的发展趋势.
【期刊名称】《化学与生物工程》
【年(卷),期】纳米氧化铋2015(032)007
二苯甲酰基甲烷
【总页数】7页(P9-14,40)
【关键词】地表水;微囊藻毒素;分析
【作 者】赵起越;赵红帅;刘保献;徐蘇士遥望宋朝
【作者单位】北京市环境保护监测中心,北京100048;北京市环境保护监测中心,北京100048;北京市环境保护监测中心,北京100048;北京市环境保护监测中心,北京100048
【正文语种】中 文
【中图分类】O657
随着经济的发展及人口的增加，地表水体富营养化日益严重，污染水体中的藻类快速生长繁殖，引发藻类水华。蓝藻水华爆发频率较高，向水体释放出大量的藻毒素，严重影响水体生态环境，威胁水生动、植物的生长及人体健康［1-2］。其中最常见的毒素为微囊藻毒素（microcystin，MCs）。MCs是一种具有生物活性的环状缩氨酸，基本结构为环（D-Aka-L-X-D-Masp-L-YAdda-D-Glu-Mdha），L、D为左、右旋，D-Aka为D-丙氨酸，D-Masp为D-赤-甲基-β-D-异天冬氨酸，Adda为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸，DGlu为D-异谷氨酸，Mdha为N-甲基脱氢丙氨酸。X和Y为两种可变的氨基酸。
MCs有近90种异构体，其中研究较多的有MCLR、MC-RR及MC-YR等。MCs具有肝毒性，是一种强肿瘤促进剂，不仅损害饮用及接触污染水体的生物健康，还会通过食物链富集，对人类健康构成威胁。微囊藻毒素溶于水，有较强的耐热性及酸碱稳定性。普通自来水处理工艺难以将其有效去除［3］。世界卫生组织（WHO）设定饮用水中MC-LR的浓度指导限值不得大于1μg·L－1［4］，我国《地表水环境质量标准》及《生活饮用水卫生标
准》均采用了WHO的浓度限值［5-6］。
微囊藻毒素浓度与蓝藻水华的程度息息相关。研发准确、快速的测定方法对控制蓝藻水华、保护地表水环境安全具有重大意义。由于微囊藻毒素种类繁多、结构相似、浓度很低，加之地表水中存在许多干扰物质，准确而快速地定量测定MCs具有一定难度。MCs的分析方法种类繁多，作者在此主要介绍生物检测法、生物化学检测法及化学仪器检测法等MCs检测方法。
生物法检测MCs是通过动、植物体外摄入MCs，观察个体或组织器官的反应变化。研究常通过灌喂或腹腔注射小白鼠鉴定MCs的毒性，周期较长。Torokne等［7］使用甲壳纲无甲目丰年虫进行了水中MCs亚致死点1 h Rapidtoxkit实验及死亡率24 h实验，两种实验结果相关性好，因此可以用1 h实验代替24 h实验，快速、经济地检测MCs。目前，使用细菌测定MCs毒性的报道较多，如费舍尔弧菌或明亮发光杆菌等，最多能检测5种MCs［8-9］。2008年，南非第一次出现了使用鲇鱼肝细胞进行动物实验的报道，细胞暴露后，进行抽样、抑制及引发等实验，结果与酶联免疫法相符，与小白鼠动物实验完全一致，该方法可能在不远的将来替代动物活体实验［10］。此外，还有使用植物检测水中MCs的报道［11］。 生物法操作简单，结果直观，但成本较高，特异性不好，无法区别不同的MCs异构体，也不能对毒素进行准确定量。
2.1 蛋白磷酸酶抑制分析法（protein phosphatase inhibition analysis，PPIA）南方少儿频道
MCs能阻断抑制真核蛋白磷酸酶PP1及PP2A的活性，因此通过测定放射性同位素32P标记底物或对硝基苯基磷酸酶类底物，获取蛋白磷酸酶PP1及PP2A的抑制情况，可以得到MCs的浓度。Rivasseau等开发了一种免疫与比实验相结合的蛋白磷酸酶抑制方法，样品经免疫萃取后进行磷酸酶抑制检测，可对MCs水华毒性进行快速的在线监测。Covaci等［12］研究了3种蛋白磷酸酶被MCs抑制的情况，使用其中2种、依据人工神经网络对MC-LR及MC-YR进行了定量检测。这种检测方法成本低，可用于常规环境样品的筛选，但特异性不好，干扰较大。
2.2 酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）
ELISA根据抗体对MCs的识别进行检测，ELISA又分为抗原抗体复合物酶联免疫法（anti-immune complex ELISA，IC ELISA）、间接竞争酶联免疫法（indirect cELISA）和直接
竞争酶联免疫法（direct cELISA）3种。雷腊梅等［13］采用水样、藻样和水产品对上述方法进行了系统比较，证明IC ELISA灵敏度高、稳定性好、特异性强，而且不需要预处理样品，检测限符合国内外相关法规要求。ELISA实验多数使用免疫诊断试剂盒进行，如Gurbuz等［14］使用自制的多克隆抗体试剂盒及一种市售的试剂盒对水体中的MCs进行了分析，同时使用液相谱对结果进行了确证。结果表明：多克隆抗体法比单克隆抗体法重复性好，制备也比较方便、快速，虽然检测限比单克隆法高，但可以满足水中MCs的测定要求。
一般的ELISA不能对不同MCs异构体区别检测，对MCs及其它有类似结构的物质也不能加以区分，因此测量结果有时会产生偏差。
目前，免疫传感器的研制工作非常活跃。将免疫测定法与传感技术相结合，产生了一类新型生物传感器——免疫传感器。此类传感器利用抗原与抗体的特异性吸附反应对目标化合物进行测定。MCs免疫传感器应用分直接测定（非标记型）及间接测定（标记型）两种［15-16］。张金果等［17］研制出基于Fe3O4@Au磁性纳米粒子修饰丝网印刷电极的免疫传感器，并进行水中MC-LR测定，其响应峰电流值与化合物浓度在0.79～12.9μg·L－1
范围内呈良好的线性关系，检测限为0.38μg·L－1。杜华丽等［18］使用基于石墨和金纳米笼修饰的无标记型微囊藻毒素免疫传感器进行污染物的测定，考察了抗原培育时间及抗体浓度等条件对传感器响应性能的影响，操作简单，稳定性很好。Shi等［19］建立了新型在线自动光度生物传感系统，使用间接竞争检测模式对饮用水中的MC-LR实现了快速、自动、在线、实时检测，MC-LR的定量范围为0.2～4.0μg·L－1，检测限可达0.09μg·L－1。Morais等［20］应用间接竞争微免疫反应研制出微传感器，实现了现场、原位、快速、高通量的分析，对水中MCLR的检测限可达1.04μg·L－1，线性范围0.12～200 μg·L－1，37 min内可同时分析42个样品。
免疫传感器特异性强、灵敏度高、准确性好，纳米材料的引入，使它的诸多性能有很大提升。但多数传感器仅能测定MC-LR，且非标记传感器分析MCs等小分子化合物时的灵敏度不够高。此外，多数传感器不能胜任大量环境样品长时间连续分析的任务，在使用寿命、再生性、有效性及稳定性等方面也需要进一步完善［21］。
2.3 分子技术检测法
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增技术，因为特异
多肽合成基因仅存在于产毒微囊藻藻株中，通过检测藻类基因组DNA中是否含有该基因簇，判断被检藻株的产毒能力，此为全细胞PCR分析法。Saker等［22］使用该法研究葡萄牙水体中MCs，检测结果与使用基体辅助激光消解-飞行时间质谱检测结果一致。Calvo等［23］使用五巢式PCR在西班牙Aragón不同水体中同时检测了5种单细胞生物，对其中主要病原体进行了识别。实时荧光定量PCR技术是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化实时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。它操作简单、快速高效，灵敏度和特异性均很高，可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增。如Juliana等［24］设计了mcyD特异片段引物，采用PCR评估了水中蓝藻数量。而Kyoung-Hee等［25］以mcyA基因为研究对象，使用PCR估算了铜绿微囊藻在蓝藻种中的比例，进行了蓝藻水华风险的评估。基因核苷酸探针DNA芯片技术大大提升了实时PCR的分析通量，对蓝藻水华测定的灵敏度可达1 000 cell· mL－1［26］。PCR技术的缺陷是，随着放大产物长度的增加，放大效率逐渐降低，优化工作难度加大，检测时间延长［27］。
3.1 前处理方法
3.1.1 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）
大多数分析方法均要使用固相萃取技术从水中提取MCs。萃取柱活化后将水样注入，再使用溶剂依次洗脱杂质及MCs，含有MCs的洗脱液经浓缩换相，使用仪器进行分析。这部分研究主要集中在萃取柱的填料、孔径、杂质及目标化合物洗脱条件的选择和比较上［28］。Sep-Pak C18、Supelco LC-Si及HLB等SPE柱的研究较多，一般认为HLB的萃取效果较好，因为其填料是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有较高的吸附容量［28-29］。
水中MCs使用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）技术的报道不多，主要因为该技术萃取平衡时间较长（＞20 h），实用性不强［30］。自动固相萃取是将SPE自动化，使用机械泵自动抽取分析水样及洗脱溶液。节约了人工，但仪器造价较高，系统维护费用及工作量较大。1999年，Lee等［31］使用一种在线富集装置，将水样过滤后，直接上机富集，富集柱为Zorbax腈基柱，流速0.3 mL·min－1。该研究使用液相谱分析了水中MC-LR、MC-YR及MC-RR。单芯片SPE技术使用芯片作固定相，可以在低压下达到较高的流速，分析速度快，灵敏度高。芯片可以反复使用，经济实惠。Ammerman等［32］开发了一种流动注射（flow injection，FI）结合单芯片SPE萃取分析地表水中痕量MCs的方法，该方法比传统SPE目标化合物的半峰宽减少近20%，灵敏度提高近10倍。
3.1.2 直接进样法
协方差直接进样法指水样不经过萃取，通过滤膜后直接进入仪器（通常为液相谱）进行分析。近年来，随着液相谱-质谱及多级质谱的出现，仪器检测的灵敏度有了很大提高，抗干扰能力也大大增强，直接进样法的报道也越来越多［33-35］。该方法的研究集中在过滤膜材质的选择和进样量、谱条件的筛选上。杨立新等［33］使用直接进样液相谱-串联质谱测定了自来水、地下水及地表水中的8种有机物，包括2种MCs，通过谱及质谱条件的优化，8种有机物于6 min内分析完毕，2种MCs的线性范围较宽，相关系数达0.99以上。姜雷等［34］使用同种方法测定了水中9种藻毒素，用脑啡肽作内标，定量限为0.012～0.360μg· L－1。茅海琼等［35］使用直接进样法分析了环境水质样品中MC-LR，采用超高效液相谱-串联质谱，回收率为91.5%～110.3%，检测限为0.08μg·L－1，符合《地表水环境质量标准》及《生活饮用水卫生标准》的要求。
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