1 绪论
钟阳阳
化学发光按其反应介质的状态，分为气相化学发光和液相化学发光两大类。NO，NO2，SO2等气相化学发光测定体系常应用于大气污染物测定；液相化学发光中常用的试剂有鲁米诺、光泽精、吖啶酯、过氧草酸酯、洛粉碱、1，2二氧杂环丁烷等，主要用于过氧化氢、金属离子，以及有机化合物的测定。鲁米诺类、过氧草酸酯类、吖啶酯类发光试剂是实际分析测定中常用的几种重要发光试剂，在药物分析，环境监测和食品分析方面有着广泛的应用[1]。 近年来，随着化学发光应用技术及仪器的发展，尤其是化学发光试剂修饰，以及化学发光与其它分析检测技术的联用，大大拓展了化学发光分析检测技术的应用领域。
1.1.1 鲁米诺化学发光体系
鲁米诺(Luminol)化学名为(5-氨基-2，3-二氢1，1二杂氮萘二酮，又名3—氨基邻苯二甲酞阱)，化学结构见图1.1。其结构简单、易于合成、性质稳定、无毒、环境友好、水溶性好，是应用最多的化学发光试剂之一。
NH2O
NH
NH
O
图1.1 鲁米诺的化学结构
Fig 1.1 The Structure of Luminol
鲁米诺的化学发光性质最早于1928年被Albrechi H O发现，他发现鲁米诺在碱性溶液中，加入过氧化氢可观测到微弱的发光现象，在此基础上加入适当的氧化剂和催化剂，可以大大提高其化学发光强度。过氧化氢酶、辣根过氧化酶、铁盐、锰盐、过渡金属离子、氨基配合物等均可以作为催化剂或氧化剂增强鲁米诺的化学发光，因此，根据化学发光检测分析的原理，由于上述物质影响了鲁米诺的化学发光速率，并进而影响其化学发光强度，使得鲁米诺可以用于上述物质的分析检测[2-3]。
鲁米诺的化学发光机理通常被认为已经被研究得比较透彻，但实际上，其被氧化中间产物还没有得到统一的结论，只是确定了其最终发光的物质为氨基邻苯二甲酸盐离子。鲁米诺的化学发光机理如图1.2所示。
鲁米诺可以用于金属离子的含量测定，测定海水中铁离子的含量的方法已经得到建立起来，并应用于海洋环境监测，另外，鲁米诺在过渡金属检测方面也得到了大量的应用；除了过渡金属离子之外，镁离子，钡离子，钙离子等碱土金属离子也可以利用鲁米诺化学发光体系进行检测[4]。过渡金属配合物会影响金属的催化特性，因此鲁米诺也可以用于过渡金属配合物的检测，进而影响鲁米诺的化学发光强度，据此可以建立过渡金属配合物的检测方法。法已经得到了广泛的应用。贵金属离子的检测也可以通过鲁米诺来实现，AuCl 4鲁米诺发光反应已应用于金的测定，该法测定灵敏度高，选择性好，干扰小，在过氧化氢存在下，已经应用于矿样中金的含量测定[5-6]。鲁米诺在非金属离子检测方面[7]最多的应用之一是用于水样中次氯酸根离子的检测，次氯酸根能够催化鲁米诺的发光，其检测限可达0.2ug/L ，与最常用的比法结果一致，但是该法准确性较比法高。
除此之外，以鲁米诺为化学发光试剂的化学发光免疫分析方法广泛应用于药物分析[8-12]，环境监测[13-14]，食品分析[15-16]等领域。
除了鲁米诺之外，异鲁米诺作为化学发光试剂比较成功的是应用于免疫分析
[18]
。蒋滋慧[19 ]等合成了生物素-氨基-丁基-乙基异鲁米诺偶联物，该异鲁米诺衍生
物与生物素结合后，化学发光强度降低，亲和素含量与发光强度的变化有定量关系。基于此特性的C-反应蛋白发光免疫测定中，标准曲线范围为1.25-160ng/mL 。批内和批间变异系数分别为 4.8%和14.8%。该法与电泳法测定同一血清样本的C-反应蛋白的相关性很好，相关系数r =0.96；异鲁米诺及其衍生物在化学发光分
NH NH O
NH 2
OH -NH
N -O
NH 2
数字助听器[O]
COO -
COO -NH 2
*
COO -
COO -
NH 2
+
hv
O
O
图1.2 鲁米诺的发光机理
Fig 1.2 The Luminescent Mechanism of Luminol
g网站析中也有广泛的应用[20-21]。
鲁米诺的合成路线较为简单，其常用的合成路线见图1.3[17]：
1.1.2 吖啶衍生物
吖啶类化学发光试剂主要有吖啶酯和吖啶磺酰胺以及光泽精，吖啶酯和吖啶磺酰胺将在下文中详细介绍，本节着重介绍光泽精及其类似物(双吖啶，吖啶酮等)的性质和应用。光泽精的化学名为：硝酸双N-甲基吖啶翁，熔点247
℃(分解)，化学结构式见图1.4。光泽精的制备是用N-甲基吖啶酮在锌粉作用下两分子缩合，再与硝酸成盐制得。
光泽精在碱性介质中可被过氧化氢等氧化剂氧化成N-甲基吖啶酮而发光，最大波长在440nm ；在有催化剂(如Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ
)、Cr(Ⅲ))存在时发光效应增强，应用这一体系可定量测定某些催化剂或催化剂标记的组分、过氧化物或可转化为过氧化物的组分[22-23]。此外，有溶解氧存在时光泽精还可与多种还原剂进行化学发光反应，这一反应己用于临床上重要的还原剂的定量分析。
图1.3 鲁米诺的合成路线
Fig 1.3 The Synthesis rout of luminol
垃圾车法则
NO 2
COOH COOH
NO 2
COONa .2
光泽精以硝酸盐的形式存在，在碱性介质中，过氧化氢将其氧化成四元环过氧化物中间体，而后裂解生成激发态的吡啶酮而发光。利用光泽精与还原剂作用，可用于测定临床医学上一些重要的还原性物质，如抗坏血酸、肌酸酐、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、乳糖、葡萄糖。
与鲁米诺相比，光泽精的发光体比鲁米诺的发光体发光更强、发光效率更高，化学发光的化学发光过程受某些还原剂的影响，如抗坏血酸、尿酸、葡萄糖醛酚，因此可用于该类物质的检测，检出限一般为10-10 ng/mL ；含α-羟羰基的化合物与光泽精会发生强烈的化学反应，如甘油、轻基乙醛、二羟基丙酮酯等，因此光泽精可以用于该类物质的含量测定。
将吖啶类化合物经结构修饰后，制成化学发光探针，用于生物大分子化学发光免疫分析始于20世纪80年代。这类化合物在H 2O 2和碱的存在下能迅速产生化学发光，其不仅适合于标识小分子，同时也适合于标识生物大分子；吖啶类化合物可在中性或微碱性条件下标识蛋白、核酸、多肽等生物大分子，被标识物量子产率和生物活性几乎不会受损。
近年来，国内外许多学者合成了很多吖啶类探针用于化学发光免疫分析，并进一步研究了这类探针标识生物大分子的性质。庄惠生[24]等人合成几种双吖啶酯发光试剂，进一步研究了双吖啶衍生物标识生物大分子的性质及其在免疫分析中的应用，其中一双吖啶酯经磺酰氯化后，用于标识抗癌胚抗原抗体，标识率高达
1.25，高于鲁米诺类和吖啶酯类化学发光标识物，同时还考察了标识反应、双抗夹心免疫反应和化学发光条件，建立了一种测定癌胚抗原抗体的双抗夹心免疫分析新方法，方法的线性范围为1.0~15.10ng/mL ，检测限为0.153ng/mL ，结果与放射免疫法相关性良好。
光泽精等吖啶类化合物还可用作DNA 探针，用于DNA 的检测分析。吖啶类的荧光反应体系简单，不需外加催化剂，只要加入适当的酸碱体系中，就可以发
(523nm)
荧光，且发光效率高，背景小，可在中性或碱性条件下测定DNA ，已成为十分有发展前景的荧光分析试剂。
Geoffrey T 等人[25]研究了一类吖啶衍生物与RNA 和DNA 的荧光性质，发现这类物质与DNA 之间存在嵌插作用，从而引起吖啶衍生物的荧光猝灭，并发现猝灭程度与DNA 在一定的浓度范围内呈良好的线性关系，基于此建立了测定
DNA 的荧光分析方法。国内在该领域内的研究方面，庄惠生[26]等人合成了发光剂10,10′-二乙基-2, 2′-二磺酸基双吖啶，并测定了其基本的荧光性质，发现DNA 能够猝灭该类双吖啶衍生物的荧光，由此建立了该双吖啶衍生物为荧光探针的
DNA 荧光分析新方法。国内外学者在对吖啶类物质进一步研究中发现生物大分子的能够参与调节预胶束聚集体阴离子表面活性剂中吖啶单体和二聚体之间的平衡，进而影响二聚体解离，使体系的荧光增强。这进一步推广了吖啶类物质作为核酸荧光探针的应用前景；许金钩等[27]建立了检测DNA 的灵敏方法，郭祥[28]等建立了吖啶橙检测核酸的灵敏方法。
1.1.3 过氧草酸酯类
最早被发现的过氧草酸酯类化学发光体为草酰氯。上世纪60年代，美国贝尔电话研究所的研究人员在进行草酰氯与过氧化氢反应时，发现在苯等有机溶剂中体系会发出微弱的蓝光，当向其中加入荧光物质后，可以观察到发光现象明显增强。20世纪70年代美国碳氰公司的Tauhut 等发现了草酸酯也有同样的性质，但是草酸酯比草酰氯更为稳定，接着合成并研究了一系列草酸酯衍生物，并将其开发用于应急光源，开发出了一系列的军用产品，并逐步走向民用[29]。
常见的几种过氧草酸酯如图1.6所示。
O C C O
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
中国实验方剂学杂志Cl
O O O C C O
Cl
CO 2R Cl Cl
RO 2C
Cl O O Cl
Cl
O C C O NO 2
X
米娅和米高人O 2N O 2N
X
NO 2
O O
O C C O Cl
CO 2R
Cl
Cl
RO 2C Cl
O O 双(2,4,6-三氯苯基草酸酯)
双(2,4,5-三氯-6-烷氧羰苯基)草酸酯
双(2,4,-二硝基-6-烷氧羰苯基)草酸酯双(2,4-二氯-6-烷氧羰苯基)草酸酯
图1.6几种过氧草酸酯的结构
Fig 1.6The Structure of Several Oxalate Ester Peroxide
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