共生菌Hamiltonella defensa研究进展 （文献综述）
摘要：Hamiltonella defensa是半翅目昆虫体内存在的一种次生共生细菌，目前在以植物汁液为食的昆虫体内发现，包括蚜虫、木虱和粉虱。这些昆虫都是农业上重要的有害生物，因而它们体内的共生菌也成为国内外研究的热点。近些年来，已有不少科学家对H. defensa进行了大量研究，本文主要介绍H. defensa及其功能的研究进展。 关键字：H. defensa；次生共生细菌；蚜虫；研究进展
1 共生细菌的概况
昆虫体内存在许多生物，这些生活在昆虫体内的生物包含很大的范围。“生活在昆虫体内的生物”至少包括（1）昆虫的肠道微生物（gut microbe），著名的例子有白蚁和蟑螂肠道内的微生物；（2）内寄生物（endoparasitism），包括内寄生蜂、真菌和线虫；（3）胞外共生体（extracellular symbiosis），例如存于蚜虫血体腔和脂肪体的类酵母体；（4）胞内共生体（intracellular symbiosis），即内共生体。昆虫内共生体是指那些生活在昆虫细胞内，与昆虫密切相关的生物。内共生体在许多昆虫种类中都有发现，Douglas在1998年曾估计大约15%的昆虫种类含有内共生体(Douglas, 1998)。目前发现的昆虫内共生体，
绝大部分是细菌。除此之外，内共生体还包括衣原体、立克次氏体、真核生物类酵母体等，以上内共生体统称为共生细菌。
昆虫中的共生细菌根据其在寄主昆虫体内的分布和与寄主进化关系可以划分为两类：（1）原生共生细菌（primary symbiont），如蚜虫（aphids）体内的Buchnera，粉虱（whiteflies）体内的Portiera，木虱（psyllids）体内的Carsonella，粉蚧（mealybugs）体内的Tremblaya 等(Baumann, 2005)。原生共生细菌分布于特化的寄主昆虫细胞-含菌细胞（bacteriocyte）内，与寄主协同进化，可以垂直卵传。一种昆虫只有一种原生共生细菌。（2）次生共生细菌（secondary symbiont），如蚜虫的Hamiltonella、Regiella、Rickettsia等(Oliver et al., 2010)，粉虱的Hamiltonella、Rickettsia、Wolbachia等(Chiel et al., 2007)。和与其共存的原生共生细菌相比，次生共生细菌和寄主昆虫的协同进化关系更短暂，更松散，其感染寄主昆虫的历史较短。次生共生细菌不局限于含菌细胞，还分布于寄主多种细胞内（如Rickettsia）(Gottlieb中小学资产管理系统
et al., 2008)，可以垂直卵传，也可以水平传播。一种昆虫可以有多种次生共生细菌。次生共生细菌也被称为facultative symbiont、guest bacteria或accessory bacteria。
2 H. defensa的概况
H. defensa隶属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），曾被称为PABS（pea aphid Bemisia like bacteri
a），也被称为T type共生细菌。2005年PABS被提名为Candidatus Hamiltonella defensa (Moran et al., 2005a)。
H. defensa是半翅目昆虫体内广泛分布的一种共生细菌，目前在以植物汁液为食的昆虫体内被发现，包括蚜虫、木虱和粉虱（Degnan，2009）。与原生共生细菌不同，H. defensa
是一种次生共生细菌。虽然它在烟粉虱体内仅局限在Portiera所在的含菌体内(Gottlieb et al., 2008)，但在蚜虫体内中，H. defensa在含菌体、肠道、卵巢等部位都可以被检测到，原位杂交显示其形态为杆状(Darby et al., 2001)。 H. defensa在寄主体内可以垂直传播，有时也可以水平传播（Oliver et al., 2005）。虽然Chen等(2000)尝试通过在同一寄主（苜蓿草Medicago sativa）上饲养蚜虫，以检验蚜虫间H. defensa的水平传播，但是仍没有发现水平传播的证据。而且寄生蜂Eretmocerus emiratus、Eretmocerus eremicus和Encarsia pergandiella均不能通过取食寄主烟粉虱（Bemisia tabaci）获得H. defensa(Chiel et al., 2009)。但Sandstrom等(2001)对大量田间蚜虫无性系的调查及显微观察发现，细菌会入侵蚜虫细胞并在蚜虫世系间进行垂直和水平传播。Degnan等(2008)结合对豌豆蚜H. defensa噬菌体（APSE）的研究发现共生细菌与噬菌体在两性之间的传播也支持H. defensa可以在蚜虫间的水平传播。 3.研究进展
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到目前为止，研究主要集中在蚜虫体内的H. defensa上，而对其他昆虫体内的H. Defensa 研究相对较少，因而下面主要介绍的是共生菌H. defensa与蚜虫之间的作用与影响。
3.1感染H. defensa的蚜虫对寄生蜂的抗性增加
目前人们已经普遍接受豌豆蚜对阿尔蚜茧蜂Aphidius erv i的抗性与共生菌H. defensa是有关联的观点（Jean-Frédéric Guay et al., 2009）。Ferrari等(2001)曾通过研究34个豌豆蚜种发现不同种豌豆蚜对两种寄生蜂（阿尔蚜茧蜂Aphidius ervi和A. eadyi）的抗性是有差异的。后来研究发现，含有H. defensa的豌豆蚜对A. eadyi的抗性最强，对阿尔蚜茧蜂的抗性次之。但是这种联系与当时使用的寄主植物有很大的关系(Ferrari et al., 2004)。
Oliver等(2003)的研究表明，在控制基因背景的情况下，豌豆蚜遭H. defensa侵染后，可以导致阿尔蚜茧蜂幼虫发育过程中的死亡率显著增高。阿尔蚜茧蜂在侵染H. defensa的豌豆蚜和未侵染H. defensa的对照豌豆蚜上产卵数目一样，但阿尔蚜茧蜂产的卵很难在侵染H. defensa的豌豆蚜上完成发育。因此，共生菌H. defensa可以保护蚜虫，抵抗寄生蜂对蚜虫的攻击，增强蚜虫在自然界的生存能力。
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虽然H. defensa是由母本垂直传播的，其在自然界中有时也可以水平传播，并建立带菌的无性系蚜虫种。不同无性系的豌豆蚜种被不同H. defensa分离株侵染后是否也对寄生蜂产生抗性？豌豆蚜对寄生蜂的抗性是否与蚜虫不同基因型有关？为此，Oliver等(2005)建立了分别含有H. defensa五种分离
株的同一豌豆蚜无性系种（其中一种分离株取自黑豆蚜A.craccivora）和含有同一H. defensa分离株的五个不同豌豆蚜无性系种，用以检测各豌豆蚜无性系种对阿尔蚜茧蜂的抗性水平。结果发现：不同H. defensa分离株的豌豆蚜种对阿尔蚜茧蜂的抗性为19%到接近100%不等，而含有同一H. defensa分离株的不同无性系种中豌豆蚜对阿尔蚜茧蜂的抗性水平相似（40%~60%）。这表明蚜虫对寄生蜂的抗性水平只与共生菌H. defensa有关，寄主蚜虫的基因型不能影响蚜虫对寄生蜂的抗性水平。
蚜虫体内的次生共生细菌的种类数对蚜虫抗寄生蜂有积极作用，共生细菌种类数越多，蚜虫对寄生蜂的抗性越强。而且H. defensa对寄生蜂的抵抗作用具有专一性(Nyabuga et al., 2010)。有试验表明，豌豆蚜被S. symbiotica和H. defensa双重侵染后，其对阿尔蚜茧蜂的抗性比任何只被一种共生细菌单独侵染的豌豆蚜产生的抗性都强。而且H. defensa-Spiroplasma 共存和R. insecticola-H. defensa共存时，豌豆蚜的被寄生后僵化的数目都有所减少(Nyabuga et al., 2010)。这说明共生细菌协同调控寄主抵抗寄生蜂寄生的现象是普遍的。而田间调查发现被共生细菌双重侵染的豌豆蚜很少，因此有人认为共生细菌可能增加了豌豆蚜子代的生存成本(Oliver et al., 2008; Oliver et al., 2006)。
为了探明感染H. Defensa的蚜虫抵抗寄生蜂的作用机理，Moran等(2005b)通过对蚜虫血淋巴中的DNA扩增得到了一些H. defensa的基因组序列和一种相关的噬菌体APSE-2（bacteriophage 2 of the A. pisum secondary endosymbiont）。对序列分析后发现，H. defensa含有2个三型分泌系统（type III s
卷积核ecretion systems，TTSS）。APSE-2含有编码细胞致死性肿胀毒素（cytolethal distending toxin，cdtB）同族体（homolog）的基因及与一种哺乳动物病原体基因类似的的基因。ctdB能阻断真核细胞的细胞周期。ctdB同族体基因在含菌蚜虫中的表达量很高，且其在APSE-2染质上的位置与stx（编码志贺毒素Shiga-toxin）同族体基因在APSE-1噬菌体染质上的位置相当(van der Wilk et al., 1999)。与APSE-2类似的噬菌卫生带
体在多种检测到的H. defensa分离株中都存在。因此，噬菌体很可能参与了蚜虫的抵抗寄生蜂的活动(Oliver et al., 2009)。H. defensa的基因组（2.1Mb）测序完成后，再次证实了Moran 的结论(Degnan et al., 2010; Degnan et al., 2009)。噬菌体的毒性基因编码的蛋白使蚜虫对寄生蜂的寄生产生抗性，而且APSE的缺失会降低H. defensa对蚜虫的保护作用(Degnan and Moran, 2008)。这些观察表明，APSE、H. defensa和蚜虫三者组成了一个复杂的互利共生体系。
3.2 感染H. defensa后蚜虫对高温耐受性的变化
Montllor等对豌豆蚜进行不同温度的处理后发现，在39℃下高温处理4h后，实验室养殖的1日龄若蚜当缺少H. defensa后无法繁殖。人工饲喂H. defensa后，豌豆蚜在热击后产生的后代数可以达到热击前产生后代数的48%。显微观察显示，不含共生细菌的豌豆蚜在热击刺激后，含菌体数目下降剧烈，仅为热击前的7%。而含有H. defensa的豌豆蚜热击后的含菌体数目是热击前的70%。对于高龄若蚜（5
日龄），含有H. defensa的个体经热击后，产生的后代数是不含H. defensa的豌豆蚜后代数的3至14倍。除此之外，豌豆蚜受热击后会产生许多死亡后代，而不含共生细菌的个体所产的死亡后代数目更多。这似乎说明H. defensa对蚜虫的耐热性有积极的作用。虽然H. defensa可以增加被侵染蚜虫的耐热性，但温度高的地区H. defensa的感染率不是最高。田间调查显示，在自然界种中含有H. defensa 的种在温暖地区比寒冷地区多，生活在最热地区的蚜虫并不是含有H. defensa的种，因此Montllor等认为温度并不是唯一决定H. defensa在田间侵染率的因素。对加利福尼亚7个地区的调查则发现，加利福尼亚地区各地平均温度与H. defensa的侵染率之间没有相关性(Montllor et al., 2002)。
3.3 H. defensa能保护植物病毒在媒介昆虫体内的传播
高三语文教学反思Morin等(1999)利用蚜虫原生共生细菌Buchnera GroEL蛋白的抗血清在烟粉虱MEAM 隐种（B）体内检测到了一种63k Da的蛋白质，该蛋白属于分子伴侣GroEL同族体。氨基酸序列比对发现，烟粉虱体内的GroEL与不同种的蚜虫共生细菌及大肠杆菌的GroEL均有较高的同源性(有80%的序列一致)。体外ligand assays显示双生病毒TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）对烟粉虱63k Da GroEL同族体表现出专一的亲和性。在获毒前给烟粉虱饲喂抗Buchnera GroEL的抗血清，TYLCV在番茄中的传染率下降了80%。在烟粉虱血淋巴中，TYLCV DNA的数量也降到了Southern 杂交的检测限之下。抗血清的存在可能干扰了烟粉虱血淋巴内GroEL同族体与TYLCV的结合，导致了病毒在烟粉虱体内含量和传播效率的大幅降低。Morin等(2000)用酵母双杂交试验对TYLCV-Is（tomato yellow leaf curl virus
from Israel）外壳蛋白（coat protein，CP）与烟粉虱GroEL蛋白进行互作研究。TYLCV-Is 的CP能与烟粉虱GroEL有效地结合起来。用GroEL抗血清在烟粉虱携毒之前结合烟粉虱体内的GroEL，结果烟粉虱传TYLCV-Is的效率下降了80%以上，且病毒在烟粉虱血体腔内的数量大大减少。也就是说，由于烟粉虱中GroEL减少，导致了其携毒量减少。这说明内共生菌产生的GroEL蛋白具有保护病毒在昆虫体内免遭降解的功能。
在以列可以传播TYLCV的MEAM 1隐种烟粉虱体内含有原生共生细菌Portiera和次生共生细菌Rickettsia和H. defensa，即烟粉虱体内存在三种GroEL蛋白。酵母双杂交和pull down assays两种方法均显示H. defensa产生的GroEL蛋白可以与TYLCV病毒互作结合，而Portiera和Rickettsia产生的GroEL蛋白则不能。这说明H. defensa的GroEL蛋白在保护病毒传播中起关键作用(Gottlieb et al., 2010)。而烟粉虱-双生病毒-植株之间的互作可能有利于烟粉虱的生长发育，从而烟粉虱与病毒之间能够建立互惠关系。例如，Mayer等(2002)报道MEAM1烟粉虱携带番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus）后在番茄植株上的产卵量提高了1.5倍。McKenzie等(2002)将相同数量的携带ToMoV的烟粉虱和无毒烟粉虱分别释放到健康番茄（Solanum lycopersicum cv. Florida Lanai）植株上，56天后，带毒烟粉虱体的卵量和若虫数量分别是无毒烟粉虱体的2.5倍和4.5倍。Jiu等(2007)发现MEAM1烟粉虱与双生病毒烟草曲茎病毒（Tabacco curly shoot virus）、中国番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus）之间也可产生间接互惠共生关系，MEAM1烟粉虱传播病毒使寄主植物烟草发病，其
在感病烟草上取食后，成虫寿命延长、生殖力成倍增加，种增长大大加快，同时后代个体又可继续传播病毒，进一步促进病毒病的流行。
3.4双因子影响下H. defensa对蚜虫的作用
H. defensa在单一高温或寄生蜂压力下对寄主的生存有积极作用，但是当两种因素同时作用时，H. defensa对寄主蚜虫的保护作用出现下降。在20℃下某些含有H. defensa的蚜虫（该蚜虫为在北美随机选择的种）对阿尔蚜茧蜂的寄生具有完全的免疫能力。然而当温度升到25℃时，这种免疫能力下降明显；30℃时免疫能力下降更剧烈。而不含H. defensa的对照组蚜虫在各个温度下均对阿尔蚜茧蜂敏感(Bensadia et al., 2006)。这表明温度对豌豆蚜的抵抗力存在负面影响。同时也暗示豌豆蚜防御共生的热敏感性（Jean-Frédéric Guay et al., 2009）。
3.5 H. defensa的侵染对蚜虫的利弊
对H. defensa侵染的蚜虫生物学性状的观察表明H. defensa对蚜虫具有有利作用。观察豌豆蚜感染H. defensa后的生物学性状后发现，没有次生共生细菌豌豆蚜的单雌平均后代数
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