中国兽医科学 2021，51 (04):509-517
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2021-03-01
D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0076 中图分类号：S859.796 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2021 )04_0509-09
胡瑶琪，侯力睿，傅榆涵，尹淑涛*
(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)
摘要：研究动物性食品中常见抗菌药环丙沙星（Ciprofloxacin,C F X)和恩诺沙星（Enrofloxacin,E N R)残留 联合肝毒性及其分子机制。以小鼠肝实质细胞A M L12细胞为模型，通过结晶紫染法与联合指数计算确定 C F X、E N R引起协同毒性的浓度比，并使用蛋白免疫印迹法、Annexin V-F1T C/P I双染法等方法探究两者联 用产生协同毒性的分子机制。结果显示：当C F X、E N R以浓度比2 : 1作用于A M L12细胞时，可显著抑制 A M L12细胞增殖，诱导细胞凋亡，产生协同毒性。C F X可激活内质网应激，从而上调B i m表达量。同时E N R 抑制A k t的激活，从而诱导B i m的转录。两者联用后显著上调B i m蛋白的表达（P<0.01)，激活caspase-3，切 割多聚D A P-核糖聚合酶（P A R P)，最终诱导caspase依赖型 细胞调亡。结论：C F)(与E N R可通过诱导A M L12 细胞发生caspase依赖型细胞；周亡，从而产生协同毒性。
关键词：环丙沙星；恩诺沙星；协同肝毒性；细胞凋亡
Synergistic hepatotoxicity and mechanism induced
by ciprofloxacin and enrofloxacin
HU Yao-qi,HOU Li-rui,FU Yu-han,YIN Shu-tao*
(College o f Food Science and Nutritional Engineering, China A gricultural University .Beijing \000S3,China)
Abstract：To investigate the synergistic hepatotoxicity and mechanism induced by ciprofloxacin (CFX) and enrofloxacin(ENR),mouse hepatocyte AML12 cells were used as the model. The concentration ratio of synergistic toxicity caused by CFX and ENR was determined by crystal violet staining and combination index. The molecular mechanism of synergistic toxicity induced by the combination of the two drugs was studied in detail by Western-blotting,flow cytometry and other detection methods. When the combination of CFX and ENR on AML12 cells at a concentration ratio
of 2 ： 1,they could significantly inhibit the proliferation of AML12 cells and induce apoptosis. CFX could activate endoplasmic reticulum stress,thus the expression of Bim was increased. ENR could inhibit the activation of Akt,thus the transcription of Bim was induced. After the combination of the two drugs,the expression of Bim protein was significantly increased,caspase~3 was activated,PARP was cleaved,and finally caspase-dependent apoptosis was induced. In conclusion,CFX and ENR can induce synergistic toxicity by inducing caspase- dependent apoptosis in AML12 cells.
Key words：ciprofloxacin；enrofloxacin；synergistic hepatotoxicity；apoptosis
* Corresponding author：YIN Shu-tao,E-mail ：yinshutao@cau. edu. cn
动物性食品中抗菌药残留一直以来备受消费者 类化合物由于具有广谱抗菌活性，是目前世界上使关注，是影响食品安全的重要因素之一。氟喹诺酮 用最广泛的抗菌药之一[n，通常可用于畜禽的
收稿日期：2020-U-20；修回日期：2020-12-28
基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFC1603005)
作者简介：胡瑶琪（1996-)，女，浙江淳安人，硕士。*通讯作者：尹淑涛（1984-)，男，湖北潜江人，副教授.博士，E-mail:yin- shutao@cau. edu. cn〇
510中国兽医科学第51卷
各种感染，特别是用于呼吸道、泌尿道和病毒性疾病 的继发性感染_2]。其中环丙沙星(Ciprofloxacin，C F X)与恩诺沙星（Enrofloxacin，E N R)是其中的2种应用 广泛的氟喹诺酮类兽药，关于二者的毒理学研究已 有诸多报道。
环丙沙星为一种广谱抗菌药，可通过抑制细菌 拓扑异构酶，使D N A合成和复制受阻而导致细菌 死亡[M]。环丙沙星对大鼠原代肝细胞可产生细胞毒 性5 ，且可导致成年雌性Wistar■白化大鼠出现肝细 胞充血、细胞内空泡化的现象'环丙沙星主要通过 诱导氧化应激，从而对肝产生毒性78]。此外，环丙沙 星通过某些间接作用诱导肝细胞程序外D N A合成 (Unscheduled D N A synthesis,U D S)[9_1°]，并可诱导线 粒体膜通透性转运孔开放，导致细胞素C释放，caspase-9、caspase_3 激活，引起肝损伤™。
恩诺沙星是一种广谱抗革兰阳性菌和革兰阴性 菌的动物专用抗菌药物，属于第3代氟喹诺酮类兽 药11]，其作用机制主要是抑制细菌D N A螺旋酶，导 致细菌蛋白的合成被抑制|2]，从而达到抗菌杀菌的 效果。有研究表明，人摄入大剂量或长期摄入恩诺 沙星超标的动物源性食品，可能会引起肝损伤％。研 究表明，恩诺沙星在S D大鼠:14]、异育银鲫15\中华 草龟[16]等动物模型中均存在一定的肝毒性，可使对 应的实验动物肝指标谷丙转氨酶(A L T)、谷草转氨 酶(A S T)上升。其作用机制主要通过抑制
肝中细胞 素P450酶，使恩诺沙星本身或其他药物代谢减 慢，血药浓度升高，从而增加产生毒性的可能>18〗。恩诺沙星还可能通过产生过氧化物和自由基诱导氧 化应激，从而对肝产生毒性1M1]。Liu等:2°：使用恩诺 沙星作用于草鱼肝细胞系，发现其可使草鱼肝细胞 中乳酸脱氢酶释放增加，丙二醛浓度升高，降低线粒 体膜电位，产生R O S，并可引起草鱼肝细胞凋亡。
目前，关于环丙沙星、恩诺沙星肝毒性主要是单 一毒性作用研究。实际上，畜禽体内可能同时残留 环丙沙星、恩诺沙星，人体也可能同时摄人这2种抗 菌药P25:，而环丙沙星与恩诺沙星具有相同的毒性
靶器官——肝，因此其肝毒性可能会放大，从而对人 类健康造成极大危害。因此，本研究拟对环丙沙星 与恩诺沙星联合肝毒性进行研究，并寻其产生毒 性作用的分子机制，旨在为更好地评价环丙沙星与 恩诺沙星联合肝毒性提供理论参考。
1材料与方法
1.1实验材料与试剂
A M L12细胞（小鼠肝实质细胞）购自A T C C细胞库。环丙沙星（纯度彡98%)、恩诺沙星（纯度98%)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DMEM/ F12培养基、胎牛血清均购自美国HyClone公司。无 菌P
B S缓冲液、胰蛋白酶均购自北京索莱宝科技有 限公司。戊二醛、二甲基亚砜、R N A酶、戊二醛 (50%)，均购自美国Sigma公司。高效R I P A细胞裂 解液、B
C A蛋白测定试剂盒、牛血清白蛋白（B S A)、T B S T缓冲液(20X)、彩虹245广谱蛋白Marker、N C 膜，均购自北京索莱宝科技有限公司。30%丙烯酰胺 购自北京人文华泰生物科技有限公司。细胞凋亡试 剂盒、caspase抑制剂z-V A D-ftnk均购自M B L International Corporation。 E C L发光液购自 爱必信（上海)生物科技有限公司。抗体:cleaved-PARP(9546S), caspase-3(14220S)，B i m(2933S)，B a x(5023S),Bak (12105),Bcl-xL(2762S),Bcl-2(2870S),phosph〇-eIF2a(S51) (3398S) ,p-Akt (9272S) ,；8-actin(4970S)，均购自 Cell Signal Technology 公司。phospho-IRE-l (S724) (381161)购自正能生物技术公司。T U
D C A购于 Cayman Chemical 公司。
1.2细胞培养与药物处理
A M L12细胞培养于含有100 m L/L的胎牛血清 和1%胰岛素-转铁蛋白-砸添加剂（ITS)细胞培养 添加物的D M E M/F12培养基中，在恒温37 °C、含50 m L/L的(：02环境中贴壁生长，每36 h传代1次。将细胞接种于6孔或12孔板，待细胞融合度达到 40%〜50%时，进行药物处理。
1.3细胞活力的检测
使用P B S缓冲液润洗后，加人戊二醛摇床上固 定15 min。弃去戊二醛溶液，用P B S缓冲液润洗后 使用结晶紫染液于摇床上染30 min。弃去染 液，并用流动的水小心冲洗每个孔，直至洗液呈无 透明，倒置晾干。每孔加人8 m L的750 m L/L乙醇，于摇床溶解4〜6 h,570 n m下测定吸光值。通过公 式计算可得每孔细胞存活率：
细胞存活率(％)=
(处理组D值-空白对照D值）
(对照组ole -空白对照z)值）
x 100%〇1.4细胞凋亡的检测
收集细胞，3 000 r/m in离心5 min。弃去上清液，并用l m L P B S缓冲液重悬细胞，再次离心。离心完 成后，弃去上清液，使用85 h L结合缓冲液重悬细 胞，并将细胞悬液转移至流式管中。避光条件下，每 管加人5此碘化丙啶（P1)和10 H L A nnexinV染液 混匀。孵育15 m in后，补加400 m L结合缓冲液混匀，用流式细胞仪FACSCaliber 检测。
第4期胡瑶琪等：环丙沙星和恩诺沙星联合肝毒性及其机制研究511
1.5联合指数的计算
使用Chou-Talalay数学模型计算联合指数(Co-mbination index，CI)。根据下式计算得到C7值:
CA,x.CB,x
~ ICx.A I C x J i。
式中：C4,x和分别是两药在联合使用时，细胞生长抑制率达到x %时的药物使用浓度，亿Y,.4和/C x，B分别是两药单独处理细胞时，细胞 生长抑制车込到；的药物使用浓度。根据实验结 果计算得出C/值，C/<1时为协同作用，C/=l时为 相加作用，C/>1时为拮抗作用。
1.6细胞周期的检测
消化收集细胞，用P B S缓冲液润洗后弃去上清 液，加人200 m L P B S彻底重悬细胞，逐滴加人预 冷的无水乙醇800 m L以固定细胞。置于一20°C冰 箱过夜。4 500 r/min离心10 min，弃去乙醇，用300 M L含RNase的P B S溶液重悬细胞，并放入37 °C恒 温培养箱孵育l h。孵育完成后，转移至流式管中，避光加人10 P g/m L的P1 10 混匀后用流式细胞仪FACSCaliber检测。
1.7蛋白的免疫印迹分析
药物处理后，加人适量裂解液充分裂解细胞，提 取细胞总蛋白，并使用B C A试剂盒测定蛋A浓度。选
取合适分离胶浓度的聚丙烯酰氨凝胶于80 V电压下进行电泳。待电泳至Marker开始分离，调整电 压至100 V，直至溴酚蓝前沿指示剂到达分离胶底 端，停止电泳。在电压100 V下转膜120 min。在含有 50 g/L脱脂奶粉的T B S T溶液中，于摇床上室温封 闭l h。封闭完成后置于目标蛋白的一抗和对应的 二抗中在摇床上孵育。使用E C L发光液使条带发出 荧光，并用X光片进行曝光、显影、定影。X光片上条带颜深浅即代表样品中相应蛋白表达量的高低。
1.8统计分析
本实验所得数据以均数土标准差（Mean 士S D)表示，运用GraphPad Prism 5分析数据，使用t检验 对比两组数据，使用单因素方差法对比多组数据，»P<0.05为显著性差异，"尸<0.01为极显著差异，有统计学意义。检测结果为3次独立重复实验 结果。
2结果
2.1环丙沙星与恩诺沙星联用增强对肝细胞的细胞毒性
在含 10m L/L F B S、0.1% ITS 的 D M E M/F12 培养基中，将A M L12细胞分别暴露于不同浓度的环 丙沙星及思诺沙星中持续6 0h，使用结晶紫染法 检测细胞活力。结果如图1A、B所示，C F X、E N R单 独处理可呈剂量依赖地对A M L12细胞增殖产生抑 制作用。根据上述实验结果，选取C F X和E N
R单独 作用细胞存活率为60%时的浓度，浓度比约为2 : 1，即 C F X250 Mmol/L,E N R 125 nmol/L，通过结晶紫 染法评价C F X与E N R的联合毒性。结果如图1C 所示，两者联用后，A M L12细胞增殖情况受到明显 抑制，细胞存活率显著降低至23.11%±2.06%。细胞凋亡检测结果（见图1D、E)显示，当250 pmol/L C F X、125 Mmol/L E N R单独作用于A M L12细胞持 续60 h时，相较于对照组无显著的凋亡。而C F X与
E N R联用后，A M L12细胞的凋亡率显著提高，达到
34.94% ±2.36%。
2.2 CFX与ENR联用协同抑制肝细胞的增殖
为探究C F X与E N R联用后的抑制作用为相加 作用还是协同作用，采用联合指数来进行评价。固定C F X与E N R浓度的比值为2 : 1，选用100〜300 ymol/LCFX 及 50〜150 pmol/L E N R作用于 A M L12细胞，持续60 h，并使用结晶紫染法检测细胞存活 率。结果(见图2A)显示，C F X、E N R单独处理，A M L12细胞的存活率略有下降，但当C F X、E N R以浓度比 为2 : 1联合处理时,A M L12细胞存活率显著下降。将各组细胞存活率代人Chou-Talalay数学模型进 行计算，得到相应的C I值。结果（见图2B)表明，不 同浓度固定比值的C F X、E N R联合作用于A M L12 细胞，计算得到的C/值均小于1。
2.3 C FX与EN R联合诱导caspase依赖型细胞凋亡
将A M L12细胞暴露于250 Mmol/L C F X和125 "mol/L E N R 中持续 60 h，通过 Western-blot 检测 细胞凋亡标志蛋白cleaved-P A R P的含量。结果（见 图3A)显示，C F X、E N R单独作用时，P A R P未发生 显著的切割，二者联用时，cleaved-P A R P的表达量 显著增加。此外，联用后，总caspase-3的表达量显 著下降，表明caspase-3发生了切割。之后，使用总 caspase抑制剂z-V A D-ftnk预处理A M L12细胞2 h 后，再将A M L12细胞暴露于250 nmol/L C F X、125 ymol/L E N R下持续60 h，检测细胞调亡。总caspase 抑制剂可有效降低联用诱导的细胞凋亡率（见图3B、
C)，凋亡率降至8.66% ±1.39%。
2.4 CFX与ENR联用可显著增强B im的表达量
结果（见图4)显示，无论是两药单独处理还是联合处理，抗凋亡蛋白M d-1、促凋亡蛋白B a x 的表
512中国兽医科学
第51卷
^ 90-
磘.
1 60-
性'
lc低通滤波器0 4000
50 100 150 200 250E N R 浓度/(M m o 卜L-1)E N R concentration
I 。30^
C F X ,250 M m 〇l/L _E N R ，125 _〇l/L 浓度 c〇ncemrati〇n
图1 C F X 与E N R 联用增强对肝细胞增殖的抑制作用
Figure 1 The combination of CFX and ENR enhanced the inhibition of hepatocyte proliferation
A ：不同浓度C F X 处理A M L 12细胞60h 后的细胞存活率；
B ：不同浓度E N R 处理A M L 12细胞60h 后的细胞存活率；
C :C F X 与E N R 单独及联
合处理A M L 12细胞60h 后的细胞存活率；D :C F X 与E N R 单独及联合处理A M L 12细胞60h 后的流式散点图；E ：凋亡数据柱状图。
A ：The viability of A M L 12 cells treated with C F X at indicated concentrations for 60 h ；
B ：The viability of A M L 12 cells treated with E N R at indicated concentrations for 60 h ；
C ： The viability of A M L 12 cells treated with C F X and/or E N R for 60 h ；
D ： Flow cytometry was used to detect the scatter diagram of apoptosis of A M L 12 cells treated with C F X and/or
E N R for 60 h. E ： Histogram of cell apoptosis data.
i f
C F X
E N R
120
90
60
30
□ Control □ E N R
□ CFX ■ C F X +E N R
100
50
150 200 25075 100 125浓度/( M m o 卜L _1) Concentration
300150
-c
篇
u .u
靶0.4
<n
维
0.2
0.2 0.4 0.6 0.8
分数效应 Fractional effect
1.0
图2 C F X 与E N R 联用对肝细胞增殖具有协同抑制作用
海商法论文Figure 2 Synergistic inhibitory effects of combining ciprofloxacin with enrofloxacin
A :C F X 、E N R 单独及联合（固定浓度比为2 : 1)处理A M L 12细胞60h 后的细胞存活率;B：根据Chou-Talalay 数学模型计算得到的F a -C I 值散点图： A ：The viability of A M L 12 cells treated with C F X and E N R alone or in combination (concentration ratio 2 ： 1) for 60 h ；
B ： The combination index chart for
C F X and E N R was plotted.
120-120n
120-50 100 200 30C F X 浓度/(/xmol-L-1) C F X concentration
Control
0° 101 102 1 03 1 04
FL1-H
E N R
■ ■■■>•
蠢
-L1.IS
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第4期谷物大脑
胡瑶琪等：环丙沙星和恩诺沙星联合肝毒性及其机制研究513
CFX,250 Mmol/L E N R
mol/L c -P A R P
caspase—3
)
3-actin
Control
z-VAD-fmk
卷‘
a
E w
0° 10' 102 103 104
FL1-H C F X +E N R
0° 10' 102 103 104
FL1-H
10°
10' 102 10J 104
10° 10' 102 105
FL1-H
104
k |
起1
^ =
思◦
C F X ,250 Mmol/L E N R ，125 M mol/L z -V A
D -f m k ,80 mol/L
浓度 Concentration
梦溪学林图3 C FX 与E N R 联合诱导caspase 依赖型细胞凋亡
Figure 3 The combination of CFX and ENR induced caspase-dependent apoptosis
A :C F X 、E N R 单独及联合处理 A M L 12 细胞 60 h 后，用 Western-blot 法检测 caspase-3、c -P R A P ;
B ：使用 caspase 抑制剂 z-VAD_fink 后，
C F X 、 E N R 联合处理得到的散点图；C ：凋亡數据柱状图。
A ： Western-blot analysis of A M L 12 cells treated with C F X and/or E N R for 60 h ,caspase~3 and c -P R A P were examined ；
B ： After using a pan-caspase inhibitor,flow cytometry was used to detect the scatter diagram of apoptosis of A M L 12 cells treated with
C F X and/or E N R for 60 h ；C ： Histogram of c e l l apoptosis data.
固晶机达量均没有明显变化。对于促凋亡蛋白Bak,C F X 、
E N R 单独处理及联合处理，都可使其表达水平相较 对照组显著上升，但是联用组的表达量并没有进一 步上调。而对于抗凋亡蛋白Be卜2、Bc hx L,C
F X 、 E N R 单独作用下两者的表达水平无显著差异，而 C F X 与E N R 联用后，可显著下调两者的表达量。2.5 C F X 与E N R 联用通过激活内质网应激诱导 细胞凋亡
将A M L 12细胞分别暴露于C F X 、E N R 单独或联 合作用中持续36 h ，使用Western-blot检测内质网应 激相关蛋白的表达水平。结果（见图5A)显示，p_eIF2a 在C F X 单独作用及C F X 、E N R 联合作用时表达水平 显著上调，且这两组中p-eIF2a 的表达量无明显差 异。此外,C F X 单独作用可明显下调p-IREl。当二者
联用后,P-1RE1的表达量出现进一步下降。
之后，使用总内质网应激抑制剂T U D C A 提前 作用A M L 12细胞2 h 后，向原培养基中加入250 Umol/L C F X 与 125 _ol/L E N R 继续作用，60 h 后 收集细胞，检测细胞凋亡率。结果（见图5C 、D )显 示，联用引起的细胞凋亡可被T U D C A 部分抑制，细 胞凋亡率显著下降，由原来的38.56% 士9.54%降低 至 20.64% ±2.80%。同时，Western-blot 结果（见图 5B )显示，内质网应激被抑制后，相较于C F X 、E N R 联用组，B i m 蛋白的表达量显著下调。2.6 C F X 与E N R 联用下调A k t 的表达量
使用Western-blot检测C F X 、E N R 单独及联合 作用于A M L 12细胞36 h 后p_A k t 的表达量。结果 (见图6A )显7K , C F X 单独作用时p-A k t 的表达量
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