周海倩;黎晓;黄志华
【摘 要】随着电子显微镜和分子生物学的发展,越来越多研究表明自噬参与了缺血性脑卒中的发生发展.一系列分子机制参与了自噬的调控,如PI3 K/Akt-mTOR、Ca2+/AMPK/mTOR、MAPK和HIF-1α/BNIP3信号通路,以及Beclin1 、LC3-Ⅱ、P62、凋亡相关蛋白和热休克蛋白等.本文就缺血性脑卒中时参与自噬的可能分子机制作一综述,为研究与缺血性脑卒中提供新思路. 【期刊名称】《赣南医学院学报》
【年(卷),期】2018(038)002
【总页数】6页(P117-122)
【关键词】自噬;缺血性脑卒中;分子机制
【作 者】周海倩;黎晓;黄志华
奥特朗托城堡
【作者单位】赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院基础医学院,江西赣州341000;赣南医学院基础医学院,江西赣州341000
【正文语种】中 文
【中图分类】R743
缺血性脑卒中发病率高，占全部脑卒中的60%～80%。通常，由于缺氧缺血性脑病和急性脑血管意外引起脑组织血流不足，继而发生脑细胞代谢障碍，最终导致脑细胞死亡和组织不可逆性损伤。溶栓是临床上有效的方法，但其有限的时间窗及高复发率使临床医生束手无策。因此，寻有效的新靶点及新药物极为迫切。 自噬(Autophagy)是通过自噬溶酶体系统对自身细胞质内异物、损伤和衰老细胞器进行吞噬降解的过程，它属于非胱冬肽酶依赖的程序性死亡。由于自噬有丝分裂后的活性蛋白质的运输和性质，生理状态下，神经元的存活高度依赖于自噬。但近来研究表明[1-2]，在缺血性脑卒中后，自噬被激活并且可能参与了缺血性脑卒中的发生发展。一系列分子机制参与了自噬的调控，如PI3K/Akt-mTOR、Ca2+/AMPK/mTOR、MAPK和HIF-1α/BNIP3信号通
路，以及Beclin1、LC3-Ⅱ、P62、凋亡相关蛋白和热休克蛋白等。本文主要介绍自噬在缺血性脑卒中的作用及其可能的分子机制。
1 自噬的概述
自噬(Autophagy)源于希腊语，意思是“吃(phagy)自己(auto)”。它是一种高度保守的细胞行为，主要参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除，在维护细胞内环境稳态方面起着重要作用。
当细胞内部条件改变，如细胞器和胞质积聚或损伤；或者细胞受到外界条件刺激，如饥饿、高温、低氧、激素刺激等，都可诱发自噬[3]。哺乳动物的细胞自噬常分为三种：大自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperon-mediated autophagy, CMA)。一般情况术语中的“自噬”指大自噬，它主要负责降解胞内稳定永存的蛋白质，以产生氨基酸来维持营养缺乏时细胞的生存。微自噬是通过溶酶体膜凹陷，直接吞噬细胞质、细胞器或细胞核，形成自噬体，再被溶酶体酶降解。分子伴侣介导的自噬具有一定选择性，分子伴侣HSC70识别带有KFERQ序列的可溶性胞质蛋白底物，最后降解带有KFERQ序列的蛋白质底物。在中枢神经系统发挥作用的主要为大自噬和分子
JY改造系统
伴侣介导的自噬[4]。
2 自噬与缺血性脑卒中的关系
细胞线粒体功能障碍、酸中毒、氧化应激、钙超载、兴奋性毒性和炎症反应等参与了脑缺血再灌注损伤的发生发展[5]，并不同程度地导致脑组织中自身异物的堆积和受损细胞的增加，进而可能诱导自噬的发生。Nitatori T等于1995年在沙土鼠短暂脑缺血后，应用透射电子显微镜观察到组织蛋白酶B(Cathepsin B )免疫阳性溶酶体明显增加，自体吞噬泡增加，这是首次发现自噬在脑缺血模型中被活化[6]。随后由Christian de 及Duve等通过透射电子显微镜观察到自噬体结构，证实了自噬参与脑缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion, I/R)[7-8]。有研究者进一步使用药理学工具或自噬相关基因敲除小鼠进行自噬诱导或抑制的研究，验证了功能性自噬在脑卒中过程中的生物学意义[9]。以上证据表明，自噬参与了脑卒中的发生发展过程。
最新研究显示[10]，在急性且严重的缺血时，可能引起“过度自噬”，将促使细胞死亡而起损伤作用；而慢性且温和的低氧状态，激发的“适度自噬”可能通过清除受损的组织和蛋白质，对细胞起保护作用。可见，在脑缺血发生发展过程中，自噬是把“双刃剑”。但无论自
噬在缺血性脑卒中起何作用，均需要启动一系列信号分子通路来完成。
3 自噬参与缺血性脑卒中可能的分子机制
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jomo3.1 mTOR信号介导的自噬 自噬性溶酶体再生(autolysosome reproduce, ALR)是哺乳动物自噬进入收尾阶段后延伸出一个管状结构并从中分离出原溶酶体，后者进一步成熟为新的溶酶体。此过程需要雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)被激活。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括mTORC1(雷帕霉素敏感型)和mTORC2(雷帕霉素欠敏感型)，其中mTORC1是主要调节靶点。哺乳动物缺氧和炎症的细胞应答通过mTOR途径信号传导，包括诱导自噬和细胞存活[11]两种，其中mTORC1起负向调控自噬的作用。当遭遇氧糖剥夺或使用雷帕霉素时，可抑制mTORC1的激酶活性，进而促进自噬。Hei C等[12]发现，缺血性脑卒中通过对mTOR抑制后可诱导自噬的发生，并能缓解急性高血糖致脑缺血损伤的大鼠脑缺血程度，这可能印证了上述“适度自噬”可能对“缓慢而温和”的缺血性损伤大脑起保护作用的观点。
3.1.1 PI3K/Akt-mTOR信号通路 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡及葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，PI3K是一种胞内磷
脂酰肌醇激酶，依据其结构和底物的特异性不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，其中Ⅲ型PI3K(Vps34)可与Becline-1形成复合物参与自噬的形成。同时，Ⅲ型PI3K(Vps34)催化磷脂酰肌醇在D3位的磷酸化生成3-磷酸磷脂酰肌醇，后者可募集细胞胞质中含“-FYVE-”或“-PX-”基序的蛋白质用于自噬体膜的形成。因此，自噬体的形成依赖于Ⅲ型PI3K(Vps34)的作用。AKT是PI3K下游主要的效应物，AKT磷酸化TSC1/2(tuberous sclerosis complex)，可阻止其对小G蛋白Rheb(Ras homology enriched in brain)的负调控，进一步使Rheb富集及mTORC1活化。在缺血性脑卒中3小时后，蛋白激酶PI3K/Akt的表达呈明显降低；12小时后高水平的神经生长因子(nerve growth factor, NGF)等可通过活化蛋白激酶PI3K/Akt信号通路抑制胱冬蛋白酶，从而减少缺血脑组织的损伤。由此可见，PI3K/Akt信号通路参与调控脑缺血过程中的急性神经损伤[13]。
Jin-Ye Wang等研究表明，选择性自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)可通过PI3K途径，对脑缺血有预防作用，且存在时间依赖性[14]。Huang L等发现姜黄素可通过激活PI3K/Akt-mTOR通路来减轻神经细胞的自噬活动，进而改善成年大鼠脑缺血再灌注损伤[15]。然而，在新生大鼠缺血缺氧模型中，应用mTOR抑制剂雷帕霉素处理后，可通过激活PI3K/Akt通路，抑制mTOR下游分子p70S6K的磷酸化，进而诱导自噬而发挥神经保护作
用，而3-MA则降低了自噬相关蛋白beclin1的表达，并取消了雷帕霉素的神经保护作用[16]。以上证据表明，PI3K/Akt-mTOR信号通路可能成为脑卒中的新靶点。但在不同缺血动物模型中，PI3K/Akt对mTOR信号的调控效应及对自噬的影响结果不一致，其相应的机制有待于进一步探究。
3.1.2 Ca2+/AMPK/mTOR信号通路 AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)和自噬在皮质扩散性抑制(cortical spreading depression, CSD)诱导的缺血耐受中发挥重要作用，AMPK介导的自噬可能代表卒中的新靶点[17]。在细胞饥饿状态下AMPK信号通路是增强自噬的重要途径。当脑内能量供应减少时，ATP/AMP 比值下降，激活AMPK,可抑制下游mTOR活性，激活自噬以获取能量[18-19]。激活的AMPK可通过两种方式抑制mTORC1：一是通过TSC2及mTOR调节相关蛋白正性调节自噬；二是通过调节AMPK-mTOR途径诱导自噬。AMPK介导的自噬有助于缺血预处理的神经保护，提示AMPK可作为缺血性脑卒中预防和的靶标[20]。而Ca2+可通过AMPK抑制mTOR，激活自噬[21]。
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麦克米伦缺口此外，Li WL等研究发现，在脑缺血过程中通过对p50(NF-κB1)基因敲除，可抑制Akt-mTO
R通路而增强自噬，进而诱导自噬性细胞死亡[22]。细胞质内的p53可以直接抑制自噬体的形成，而活化的p53则进入细胞核内促进AMPKβ表达，并反式激活sestrin-1,2，最后抑制下游的mTOR 活性来诱导自噬[23]。脑I/R可以诱导p53依赖的核因子NF-κB表达，损伤调节自噬调控因子(damage-regulated autophagy modulator, DRAM) 是p53依赖性自噬的正性调节因子。在I/R过程中，DRAM介导的NF-κB/p53信号通路参与了细胞凋亡和自噬性细胞死亡；自噬和凋亡机制也能通过调节p53途径参与程序性细胞死亡[24]。这提示NF-κB-p53 信号分子最终也是通过mTOR介导自噬的，该分子亦可能作为卒中的潜在靶点。
3.2 MAPK信号通路 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)由p38，细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)构成。缺血性脑卒中早期p38 MAPK信号通路的活化能促使Elk1、CHOP10、LEF2C、蛋白激酶MAPKK2/3，以维持神经元的生存和发挥抗炎症、抗凋亡等作用。在晚期p38 MAPK呈过度激活，则可能促进靶基因表达激活转录因子和胱冬蛋白酶等，反而促进神经元的凋亡，因此，在缺血性脑卒中不同时期，针对p38 MAPK信号分子应给予不同的干预。已有相关研究证明了这个观点，如黄连解毒汤可通过激活ERK、抑制JNK和p38 MAPK信号诱导保护性自噬，有利于缺血性脑卒中[25]。而
Akt/Smads信号通路通过抑制JNK和p38 MAPK分子，负调节缺氧缺糖(oxygen glucose deprivation, OGD)诱导的PC12细胞自噬[26]。应用p38抑制剂，可以促进细胞存活信号通路(如ERK)，减弱因缺血引起的线粒体碎裂或线粒体自噬，从而缩小缺血后脑梗死体积，保护神经功能[27]。以上证据表明，ERK、JNK和p38 MAPK介导了缺血性脑卒中自噬的分子过程，其中ERK激活后，抑制自噬，而JNK和p38 MAPK反之。
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