基础医学与临床Basic&Clinical Medicine
May2021 Vol.41No.5
2021年5月
第41卷第5期
文章编号：1001-6325(2021)05-0698-06研究论文
miR-183靶向Bnip3l对缺氧/复氧的
列车运行时刻表
马家玲，高艳平重庆创模
*
我所认识的蔡孑民先生
(张家港市第一人民医院苏州大学附属张家港医院麻醉科，江苏张家港215600)摘要：目的探讨miR-183调控缺氧/复氧(H/R)的海马神经元细胞线粒体自噬的机制。方法将小鼠源海马神经元HT-22细胞分为对照组、缺氧/复氧模型组(HR组),miR-183过表达组(miR-183mimics组)、阴性对照组(miR-183NC组)。用缺氧3h+复氧12h方法建立缺氧/复氧模型,miR-183mimics组及miR-183NC组在HR组基础上转染miR-183mimics及miR-183NC O MTT法检测HT-22细胞存活率，透射电镜观察线粒体超微结构,RT-qPCR检测miR-183、Bnip31mRNA水平;Western blot检测Bnip31、beclin-1、泛素和LC3结合蛋白p62(p62)、微管相关蛋白轻链3(LC3-n)/LC3-1表达。用双荧光素酶报告实验验证miR-183与Bni P3l的靶向关系。结果与对照组相比,HR 组HT-22细胞自噬体增多，细胞存活率、miR-183及p62蛋白表达降低(P<0.05),Bnip31mRNA及蛋白、beclin-1和3 (LC3-II)/LC3-I蛋白表达增高(P<0.05)；miR-183mimics组除细胞存活率降低外其余上述指标均与HR组相反(P<0.05)；与miR-183NC+Bnip31-3'UTR-WT组相比，miR-183mimics+Bnip31-3'UTR-WT组荧光素酶活性降低(P<0.05)o结论miR-183过表达可靶向抑制血Q3Z表达，降低线粒体自噬，加重HT-22细胞H/R损伤。 关键词：微小RNA-183腾马神经元细胞；线粒体自噬
中图分类号:R742文献标志码:A
Effect of miR-183targeting Bnip3l on mitochondrial
autophagy in hypoxia/reoxygenated hippocampal neurons in mice
MA Jia-ling,GAO Yan-ping*
(Department of Anesthesiology,Zhangjiagang First People's Hospital,Zhangjiagang Hospital Affiliated to Suzhou University,
Zhangjiagang215600,China)
Abstract:Objective To explore the mechanism of miR-183regulating mitochondrial autophagy in hypoxia/reoxygenated(H/R)hippocampal neurons・Methods The mouse hippocampal neuron HT-22cells were collected and divided into control group,hypoxia/reoxygenation(H/R)model group(HR group),miR-183over-expression group(miR-183mimics group),and negative control group(miR-183NC group).The anoxia and reoxygenation models were established by the method of anoxia3h+reoxygenation for12h,miR-183mimics group and miR-183 NC group were transfected with miR-183mimics and miR-183NC on the basis of HR group.The survival rate of HT-22cells was measured by MTT method,the ultra structure of mitochondria was microscopied and the levels of miR-183and mitochondrial autophagy related genes Bnip31mRNA were detected by RT-qPCR；Western blot was
收稿日期：2020-05-28修回日期：2020-10-10
基金项目：2019年度张家港市卫生青年科技项目(ZJGQNKJ2019M)；江苏大学2018年度临床医学科
技发展基金(JLY20180171)
*通信作者(corresponding author):
马家玲miR-183靶向Bnip3l对缺氧/复氧的小鼠海马神经元细胞线粒体自噬的影响699
used to detect the expression of autophagy related proteins Bnip31,beclin-1,ubiquitin and LC3binding protein p62(p62),microtubule related protein light chain3(LC3-II)/LC3-I.The targeting relationship between miR-183and Bnip31was verified by double Luciferase Report.Results Compared with control group,the autophagy of membrane structure in HT-22cells increased in HR group and miR-183nc group,and melanin remained after autophagy,cell survival rate,miR-183and p62protein expression were all decreased(P<0.05),the expression of Bnip31mRNA and protein,beclin-1and microtubule-associated protein1light chain3-II(LC3-U)/ LC3-I proteins all increased(P<0.05);In the miR-183mimics group,except for the reduced cell survival rate,all the above indicators were opposite to the HR group with statistical significance(P<0.05).Compared with miR-183NC+Bnip31-3'UTR-WT group,the activity of luciferase in miR-183mimics+Bnip31-3f UTR-WT group decreased(P<0.05).Conclusions The over-expression of miR-183can target at inhibiting the expression of Bnip31mRNA,the mitochondrial autophagy of HT-22cells,and thus aggravate the damage of HT-22cells caused by H/R.
Key words:microRNA-183；hippocampal neurons；mitochondrial autophagy
大脑海马对缺血缺氧非常敏感，是大脑缺血/再灌注(ischemia/r eperfusion,I/R)损伤的好发部位之一，而大脑海马神经元受损会引起认知功能障碍，是脑损伤的主要表现之一⑴，故抑制海马神经元受损，是缓解I/R脑损伤的重要手段之一。目前研究发现，线粒体自噬与脑I/R损伤关系密切，其自噬不足或过度激活均可导致神经元细胞变性和死亡而加重脑损伤⑵。研究证实miR-183可抑制自噬并刺激细胞凋亡⑶，且miR-183也可在大脑皮质中特异性表达，并参与神经细胞分化和调控⑷。但miR-183抑制线粒体抑制自噬对I/R脑损伤过程海马神经元的影响，报道较少。腺病毒基因Bcl-2同源蛋白［B-cell leukemia/lymphoma2(Bcl-2)/adenovirus E1B interacting protein3-like,BNIP3L］是介导脑内线粒体自噬，减轻脑缺血损伤的必须成分⑸。但Bni P3l与miR-183的靶向作用还尚不清楚，本研究建立双荧光素酶报告试验对两者的靶向作用，进行验证，并复制海马神经元细胞(HT-22)缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型来模拟I/R损伤模型，探讨miR-183靶向调控Bnip3l表达对海马神经元细胞线粒体自噬的影响及作用机制，以期阐明I/R脑损伤的分子生物学机制，为临床研究提供可靠资料。
1材料及方法
1.1材料
1.1.1细胞系：小鼠源海马神经元细胞系HT-22(ATCC:American Type Culture Collection)。
1.1.2主要试剂：miR-183激动剂(miR-183 mimics,Signosis公司)及阴性对照(miR-183NC) (System Biosciences公司)；四甲基偶氮哩蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma-Aldrich公司)；Trizol试剂盒(北京麦瑞博公司)；反转录RT试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基(Hyclone公司);BCA蛋白定量试剂盒、胰蛋白酶(Pierce公司)；泛素和LC3结合蛋白p62(ubiquitin-and LC3-binding protein p62,p62)抗体(北京博奥森生物技术有限公司);BNIP3L抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)；自噬相关蛋白beclin-1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；微管相关蛋白轻链3 (microtubule-associated protein1light chain3,LC3-II)、LC3-I抗体(北京索莱宝科技有限公司)。
1.2方法
1.2.1HT-22的分组及处理：收集对数期细胞，以每孔2X105个细胞接种于6孔板上，适应性培养24h后，将其分为对照组、缺氧/复氧(hypoxia/reoxy-genation,H/R)模型(HR)组、miR-183过表达组(miR-183mimics)、阴性对照(miR-183NC)组。对照组细胞不任何处理，使其自然增值；除对照组外，其余各组细胞均按文献［6-7］方法于3气培养箱中缺氧3h，复氧12h建立缺氧复氧模型,miR-183 mimics组和miR-183NC组分别在缺氧3h后转染miR-183mimics和miR-183NC试剂，转染后进行复氧12h培养，转染方法严格按照Lipofectamine™
700基础医学与临床Basic&Clinical Medicine2021.41(5)
2000转染试剂盒说明书进行。各组细胞按上述方法处理后，收集细胞，以备后续试验。将新购的HT-22细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的高糖DMEM培养基中，置于条件为37弋、5%CO2的恒温培养箱中培养48h，当细胞汇合度＞80%后，进行常规传代、计数。
1.2.2MTT法测定HT-22细胞存活率：取对数期细胞，每组设置6个复孔，向每个孔中加入20puL MTT溶液（5g/L），随后在37弋下再孵育1h，小心丢弃含有MTT溶液的培养基，并加入200|jl L二甲基亚枫（DMSO）以溶解沉淀物。使用自动多孔分光光度计测量490nm的吸光度（A）值，存活率（％）=实验组A值/对照组A值x100%。
1.2.3透射电镜观察线粒体结构：细胞按文献[7]方法加入5mL 2.5%戊二醛固定、磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，用1%四氧化娥在4兀下固定30min、PBS洗涤后，用2%醋酸铀水溶液染30min、乙醇梯度脱水,3mL纯丙酮-EPON812包埋后，于37、45、60七烘箱内烘烤固化后，切成1firn 切片,2%醋酸铀染并切成50nm超薄切片，用醋酸-柠檬酸染后于JEM-1200EX透射电镜下观察线粒体超微结构。
1.2.4RT-qPCR检测各组细胞miR-183、Bnip31 mRNA相对表达水平：利用Trizol试剂盒抽提细胞总RNA，应用反转录试剂盒将1jig RNA反转录为cDNA，反转录体系为10|jl L（2jjl L5x reaction mix, 1jjl
L random primer,0.5|jl L反转录酶,5|xL RNA样品），反应条件（置于42弋60min,85弋5min灭活反转录酶活性）。将cDNA稀释10倍进行RT-qPCR 反应，反应体系为cDNA4|jl L，正向引物、反向引物各0.4|jl L,SYBR Green/Flourescein qPCR Maxter Mix10fiL，去离子水5.2|jl L o反应条件为95弋预热3min,95°C30s,60弋30s,72弋15s,±述3步骤35次循环，725min终止反应。miR-183以为内参基因,Bnip31mRNA以|3-actin为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成设计（表1）。用2"ACt算法计算miR-183、Bnip31 mRNA相对表达量。
1.2.5Western blot检测BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-H/LC3I蛋白表达：取各组细胞，加细胞裂解液裂解细胞，离心分离后，取上清液提取蛋白，按BCA
表1RT-qPCR引物序列
Table1RT-qPCR primer sequences primer name direction sequence(5'-3')
miR-183F：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG
R：CAATTCAGTTGAGAGTGAATT Bnip3l F：ATGGGATTGGTCAAGTCGGC
R：CTGAGAGTAGCTGTGCGCTT
R：ATGAGC1TGGACCGGTACTC P-actin F：CCCATCTATGAGGGTTACGC
R：nTAATGTCACGCACGATTTC U6F：GCTTCGGCAGCACATATACTAAT
R：CGCTTCACGAATITGAGTGTCAT
试剂盒说明书测定蛋白浓度，并灌制SDS-PAGE 凝胶后，取200pug蛋白进行SDS-PAGE，接着将全部蛋白转移至硝酸纤维素膜上，并置于5%的脱脂奶粉溶液中，于摇床上37兀封闭2h，将目的蛋白条带，置于孵育盒中，加入抗体（BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-H、LC3-I,0-actin（内参），1:1000、1:500,1:1000、1:1000,1:2000）于4弋冰箱中孵育过夜，经TBST漂洗3次，加入1:1000的羊抗兔二抗溶液，于摇床上室温孵育2h，经TBST再次漂洗3次，采用增强化学发光法显，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以Image-J软件分析各组蛋白相对表达。
1.2.6双荧光素酶报告基因试验：合成Bnip31的3，非翻译区（3，UTR）的miR-183识别序列，克隆至pmiRGlo载体，得到pmiRGlo-Bnip31-3'UTR-WT。另外对miR-183识别区Bnip31碱基进行突变连接至pmiRGlo载体，得到得到pmiRGlo-Bnip31-3/UTR-MUT，分别将pmiRGlo-Bnip31-3'UTR-WT、pmiRGlo-Bnip31-3,UTR-MUT质粒与miR-183NC、miR-183 mimics共转染，分为miR-183NC+Bnip31-3,UTR-WT 组、miR-183mimics+Bnip31-3/UTR-WT组、miR-183NC+Bnip31-3,UTR-MUT组、miR-183mimics+ Bnip31-3，UTR-MUT组,24h后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书添加萤火虫和海参荧光素酶试剂上机检测。每孔的数值以萤火虫荧光活性/海参荧光活性显示，试验重复3次。
1.3统计学分析
以SPSS22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以平均数土标准差（历土s）表示，组间比较进行
马家玲miR-183靶向Bnip3l对缺氧/复氧的小鼠海马神经元细胞线粒体自噬的影响701
单因素方差分析，进一步两组间比较行LSD-i检验。2结果
2.1各组HT-22细胞存活率比较
与对照组相比,HR组和miR-183NC组细胞存活率均下降(P<0.05)，与HR组和miR-183NC组相比, miR-183mimics组细胞存活率降低(PvO.05)(表2)。
表2各组HT・22细胞存活率比较
Table2Comparison of survival rate of HT-22cells
in each group(r±.s9%,n=6)
group HT-22
control100.55±12.15
HR64.55±11.23
*
miR-183NC62.55±13.01
*
miR-183mimics43.09±10.14*#a
*P<0.05compared with control group；#P<0.05compared with HR group;A P<0.05compared with miR-183NC group.
2.2备组HT・22细胞线粒体结构观察
对照组细胞核仁明显，线粒体结构清晰，核糖体丰富;HR组和miR-183NC组核仁消失，膜状结构自噬体增多，可见线粒体自噬及自噬后残留的黑素；miR-183mimics组细胞核固缩，膜状结构自噬体较少，线粒体结构紊乱，甚至模糊(图l)o
niiR-183NG niili-183mimics
图1透射电镜观察线粒体超微结构
Fig1Ultrastructure of mitochondria observed by
transmission electron microscope(x2500)2.3各组HT-22细胞miR・183、Bnip31mRNA表 达水平
与对照组相比，HR组和miR-183NC组细胞miR-183表达下降(PV0.05),Bnip31mRNA表达升高(P<0.05)；与HR组和miR-183NC组相比,miR・183mimics组细胞miR-183表达升高(P<0.05), Bnip31mRNA表达降低(P<0.05)(表3)0
2.4各组HT-22细胞自噬相关蛋白BNIP3L、becliii・l、p62、LC3・II/LC3I相对表达水平
与对照组相比，HR组和miR-183NC组细胞BNIP3L、beclin-l、LC3-n/LC3I表达升高(Pv0.05), p62表达下降(P<0.05)；与HR组和miR-183NC组相比，miR-183mimics组细胞BNIP3L、beclin-1、LC3-D/LC3I表达下降(P<0.05),p62表达升高(P<0.05)(图2，表4)。
表3各组HT-22细胞miR・183、Bnip31mRNA
相对表达水平
Table3Relative expressioii levels of mir-183and Bnip31 mRNA in HT-22cells of each group(x±s,e=6)
group；A P<0.05compared with miR-183NC group.
group miR-183Bnip31
control 1.03±0.11 1.12±0.10楚雄师范学院学报
HR0.65±0.10
* 1.48±0.12
*
miR-183NC0.62±0.09
* 1.50±0.13*
miR-183mimics L62±0.13
*#a0.32±0.11
**A
<0.05compared with control group;#P<0・05compared with HR
图2Western blot检测各组HT-22细胞BNIP3L、
beclin-l、p62、LC3-H/LC3I蛋白表达
Fig2Western blot of BNIP3L,beclin-1,p62,
LC3-H/LC3I protein expression in HT-22
cells of each
group
702
基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine
2021.41(5)
*P<0.05 compared with control group；怕<0.05 compared with HR group; A P<0. 05 compared with miR-183 NC group.
表4 各组细胞BMP3L 、bediEL 、p62、LC3-II/ LC3 I 蛋白表达水平
Table 4 Protein expression levels of BNIP3L, beclin-1, p62, LC3- U/ LC3 I in each group(x±s, «=6)
group beclin-1p62LC3-H BNIP3L
control
1.03±0.24
0.96±0.22 1.12±0. 23 1.16±0. 21
HR
1. 63±0.21 *0.49 土 0.29*
1.72±0.26* 1.75 土 0.24*miR-183 NC拉伸性能
1.61 ±0.22*
0.48±0.22
* 1.73±0.28
* 1.74土 0.25*
miR-183 mimics
0. 53±0.24*#a
1.53 土 0.25 •松
0.43 ±0. 27*#a 0.49土 0.26 “a
2.5 双荧光素酶法检测iniR ・183与劭勿3Z 关系miRtarbase 预测显示,miR-183 与 Bnip3l mRNA
3PTR 区域有结合位点。双荧光素酶报告基因检测 显示，与 miR-183 + Bnip31-3#UTR-WT 组比较，miR-
183 mimics+Bnip31-3'UTR-WT 组荧光素酶活性降低
(P<0.05)(图 3)。
>塔
IruosuJIOnu
3，cgaCUCAACUGGUGUCGUGGAGCGG5‘ miR-183
T<0.05 compared with miR-]83NC+Bnip31-3'UTR-WT
图3 miRtarbase 预测miR-183与Bnip3l 的靶向关系
及双荧光素酶报告基因分析结果
Fig 3 Prediction of targeting relationship between
miR-183 and Bnip3l by miRtarbase and
analysis of dual-luciferase reporter gene
3讨论
VR 损伤引起的脑损伤，是导致成年人致死和
致残的主要原因之一，其病理和生理过程复杂，涉及 神经元细胞的凋亡、自噬、炎性反应、修复等过程。
体外培养经过永生化处理的海马神经元HT-22细
胞并建立缺氧/复氧(H/R)模型，可直接观察细胞 形态并监测其生理、生化、代谢等功能的改变，是研
究1/R 损伤体外细胞水平的最佳手段⑻o 在短暂全脑缺血/再灌注后海马锥体神经元上 可观察到自噬空泡等自噬现象⑼，研究证实，在脑
损伤初期，自噬激活对低氧引起的脑缺血神经细胞 有保护作用［⑹，氧糖剥夺2 h 后，用自噬抑制剂抑
制自噬可加重脑损伤，反之用雷帕霉素诱导自噬可 减少神经元凋亡缓解脑损伤［⑴，另外在氧糖剥夺
6 h 后用自噬抑制剂处理可缓解脑损伤，而用自噬激
活剂处理，神经元及脑损伤反而加重，表明在脑损伤
初期抑制自噬可加重神经元和脑损伤，而在脑损伤 后期抑制自噬可减缓脑损伤。本研究用氧糖剥夺
3 h 后复氧6 h 处理HT-22神经元细胞，发现HR 组
HT-22细胞存活率低于对照组，电镜下观察可见线
粒体自噬及自噬后残留的黑素、膜状结构自噬体 等均增多，提示缺氧3 h/复氧12 h 神经元细胞中线
粒体自噬被激活。miR-183能够抑制自噬，且在人 大脑皮质中有特异性表达，并参与神经细胞分化和 调控［⑵，本研究在HR 组缺氧/复氧HT-22细胞中
也检测到miR-183的表达，且miR-183的表达低于 对照组，提示缺氧3 h 复氧12 h 后，自噬激miR-
183 表达降低，表明miR-183低表达参与神经元细
胞自噬激活过程。又有研究证实miR-183过表达可
抑制细胞的自噬，促进凋亡⑷。本研究过表达miR-
183 后，发现 miR-183 mimics 组 miR-183 增高后,郭池
HT-22存活率低于HR 组，电镜下观察可见，膜状结
构自噬体减少，线粒体出现结构紊乱、甚至模糊等损 伤现象，表明过表达miR-183可抑制缺氧3 h 复氧
12 h 神经细胞线粒体自噬和细胞生存。
BNIP3L 位于线粒体外膜，低氧刺激下BNIP3L
表达升高，可促进Beclin-1蛋白的游离释放，并调控
下游多种自噬相关Atg 蛋白在自噬前体结构中的定 位，从而激活线粒体自噬的发生［⑶，另外,BNIP3L
也可与自噬相关基因Atg8相似同源物LC3和P 62 结合并介导自噬体靶向清除损伤的线粒体［⑷。如 发现BNIP3L 也是介导缺血脑内线粒体自噬发生所
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议