【DOI】10.3969 / j. issn. 1671-450. 2021. 04.016论著•基础
内质网应激与自噬的影响
吴晓曼，张敏，田甜，李明，廖星晨，谭诗云
基金项目：湖北省自然科学基金（019CF B142)
作者单位：430060武汉大学人民医院消化内科/消化系统疾病湖北省重点实验室
通信作者：谭诗云，E-m ail:tans h iyi r n@m e dm ai l.c
【摘要】目的观察二甲双胍对游离脂肪酸（FFA)诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)HepG2细胞模型内
质网应激（ERS)及自噬的影响。方法2020年7—11月于武汉大学人民医院消化系统疾病湖北省重点实验室进行 实验。分别用0(空白对照）、10、20、40、80以1^1/[的二甲双胍处理只叩〇2细胞24 11，评估二甲双胍
对细胞活力的影
响。取对数生长期HepG细胞分为对照组（BSA组）、模型组（FFA组）、二甲双胍低浓度组（M etL组）、二甲双胍高浓
度组（Met H组)4组，FFA、Met L、Met H组利用FFA处理HepG2细胞2h建造NAFLD细胞模型，Met L、Met H组分
别加人1mmol/L和10 mmol/L二甲双胍干预其过程。Wetem-blot法分别检测HepG2细胞ERS相关蛋白磷酸化 PERK(p-PERK)、ATF4及自噬相关蛋白P62、LC3表达水平的变化，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测ATF4 mRNA 表达。结果二甲双胍可剂量依赖性地降低HepG2细胞活力（F/P = 1 759. 000/0. 000)。与BSA组比较，FFA组内卩- PERK、P62、ATF4 蛋白和 mRNA 表达水平增高（/P = 3. 273/0. 029、16. 190/0. 000、47. 290/0. 000、13. 730/0. 000)，LC3
n / I 比值下降〇/P = 17. 980/0. 000)；与 FFA 组比较，Met L 组和 Met H 组 p-PERK、P62、ATF4 蛋白和 mRNA 表达水
时代广场的蟋蟀全文平降低（F/P = 70. 310/0. 000、106. 700/0. 000、995. 600/0. 000、66. 960/0. 000)，LC3 n/ I 比值升高（F/P = 166. 400/
0.000)，且与Met L组比较，Met H组上述指标变化更明显（P <0.05)，但P62水平比较差异无统计学意义(P >0.05)。
结论二甲双胍可降低FFA诱导的NAFLD细胞模型ERS水平并提高细胞自噬水平。
【关键词】非酒精性脂肪性肝病；二甲双胍；内质网应激；自噬
【中图分类号】R575. 2 【文献标识码】A
Mfects of metformin on endoplasmic reticulum stress and autophagy in a cell mo ease.Wu Xiaoman，Zhang Min，Tian Tian，Li Ming, Liao Xingch e n,T an Shiyun. Department of Hospital of Wuhan University/Hubei Key Laboratory of Digestive System Disease，Wuhan 43/06，China
Correspondiny author： Tan S h i/n，E-mail: *********************
Fundiny proyram：Hubei Province Natural gcience Founnatioo(2019CFB142)
【A b str a ct】O bjectiv e To observe the effect of metformin on the endoplasmic reticulum stress (E R S)and autoph-
agy in a H e p G2 cell model of non-alcoholic fatty liver disease(N A F L D)induced by free fatty acid(F FA).M et h o ds From
July2020 to November2020, the experiment was conducted a t the Hubei K ey Laboratory of Digestive System Diseases,
Renmin Hospital of Wuhan University.H e p G2 cells were treated with metformin a t concentrations of0,10,20,40, and80
m M for24 hours,and the cell counting kit was used to evaluate the effect of metformin on cell viability;the concentration
within10 mmol/L was selected for subsequent experiments.The cellswere divided into four groups:control group(BSA
group),model group(FFA group),metformin low-concentration group(Met L group)and metformin high-concentration
group(Met H group).H e p G2 cells were treated with F F A for24 hours to build N A F L D cell models and then metformin
were added to interfere with the process.Western blot was used to detect the expression levels of E R S-related proteins phosphorylated P E R K(p-P E R K),A TF4 and autophagy-related proteins pE2 and L C3in H e p G2 cells,and the expression of
ATF4 m R N A was detected by real-time fluorescent quantitative P C R(q RT-P C R).R esult s Metformin can reduce the via
bility of H e p G2 cells in a dose-dependent manner(%/# = 1 759.000/0.000). Compared with the control group,the expres
sion levels of p-P E R K,p62, A TF4 protein and m R N A in the model group increased(t/P=3. 273/0. 029, 16.190/0.000,
47.290/0.000, 13.730/0.000), and the ratio of L C3n/1 decreased ($/#= 17.980/0.000); compared with the model
group,the expression levels of p-P E R K,p62,A TF4 protein and m R N A in the metformin low-conce
ntration group and high-
concentration group decreased(F/P w7〇.31〇/〇.〇〇〇> 106.700/0.000, 995. 600/0.000, 66.960/0. 000), and the ratio of L C3H/1increased{F/P^166. 400/0. 000).Conclusion Metformin can reduce the level of E R S and increase the level of autophagy in N A F L D cell models induced by free fatty acids.
[K e y words】Non-alcoholic fatty liver disease'Metformin;Endoplasmic reticulum stress'Autophagy
非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,N A F L D)是全世界慢性肝病 的最常见原因，据估 计，世界上有24%的人口患有N A F L D，到2030年，美 国将有大约1亿人患有N A F L D [1]。N A F L D的阶段范 围从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎“^-- coholic steetohepatitis，N A S H)，进一■步可能发展为肝硬 化，导致肝功能衰竭需要肝移植，甚至最终发展为肝细 胞癌[2]。N A F L D近年来大多共识为一种代谢性疾病，其发病机制多与脂肪代谢有关，肝细胞三酰甘油（T G)积累是N A F L D的标志，在肝细胞中由于过多的脂质蓄 积可引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，E R S)与自嗟的变化[-]。在N A F L D发病机制的研究 中发现，代谢因素（如胰岛素抵抗、糖毒性和脂毒性 等）、遗传因素和其他因素促成N A F L D与2型糖尿病 (T2D M)的发病呈现相关性，患者存在T2D M增加了 N A F L D进一步发展的风险[5]。而二甲双胍作为一种 双胍类降糖药物，已被用于2型糖尿
病超过60 年[7]。在近期的研究中[]，发现二甲双胍可抑制高 脂饮食（H F D)诱导的肝脂肪变性。本研究利用游离脂 肪酸(F F A)建造N A F L D细胞模型并用二甲双胍进行干 预，进一步研讨E R S与自嗟的调控机制，报道如下。
1材料与方法
1. 1材料（1)细胞株：人肝癌细胞株H e p G2由中国 科学院干细胞库提供。（2)试剂试药：二甲双胍购于 美国 M C E(H Y-17471A)，Gibco D M E M/H 培养液购自 美国赛默飞世尔公司，胎牛血清（F B S)购自杭州四季 青公司。棕榈酸（palmitic acid，P A)(P0500)、油酸 (oleic acid,O A) (01383 )购自美国 Sigma公司，细胞 计数试剂盒—（cell counting kit-8，C C K-8)、胰酶细胞消 化液购自biosharp公司，无脂肪酸牛血清白蛋白（bo- vine serum a l b umin，B S A)购自上海翊圣公司。兔抗 R N A依赖的蛋白激酶样E R激酶（R N A-dependent protein kinase-like E R eukaryotic initiation factor-2a kinas e,P E R K)抗体、兔抗激活作用转录因子々（activating transcription factor 4，A T F4) 抗体、兔抗微管相关 蛋白 1 轻链 3 (microtubule-associated protein 1light 3，L C3)抗体均购自美国 Cell Signaling Technology 公司，兔抗P62抗体、鼠抗G A P D H抗体购自美国proteintech 公司，兔抗磷酸化P E R K抗体购自北京博奥森公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔I g G(Z B-2301)购自北京 中杉金桥公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG (B S12478)购自美国bioworid公司。（3)仪器设备：T H E R M O H e r a c e l l V I O S 160i/250i C02 培养箱（德国 T h e r m o Scientific公司），Bio-Rad imark 全自动酶 标仪、Bio-Rad凝胶成像系统 C h e m i D o c™X R S +、0L Y M P U S 1X71显微镜、垂直层流洁净工作台（青岛海尔公司），X B70-F Z制冰机（G R A N T公司），X S R205微量称重台 (M E T T L E R T0L E D0公司）。
1.2实验方法2020年7 —11月于武汉大学人民医 院消化系统疾病湖北省重点实验室进行实验。
1.2.1 F F A配置：以配置 F F A6 m l(0A:P A=2 : 1) 为例，先称量无脂肪酸B S A1.2 g加入P B S 2.5 m l高 速离心助溶后配至3 m l，配置成40%无脂B S A淡黄 澄清溶液。取N a0H 0.04 g，溶解于去离子水10 ml 中，配成0. 1m〇l/L N a0H溶液10 m l，取N a0H溶液3 m l 依次加入P A10.24 m g、0A25. 38 pl配置40 m m d/L F F A，置于75°C水浴进行充分皂化约30 m i n得到澄清液体。将其与B S A3 m l迅速混合，可在 50 C以下助溶，得到20 m m〇l/L F F A溶液6 m l为母 液，4 C保存。
1.2.2 H e p G2细胞培养：将冻存的H e p G2细胞置于 37 C恒温水浴中约1m i n内迅速解冻，离心5 m i n后 去除冻存液，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的D M E M完全培养基重悬之后移至25 c m2的培养瓶中，置于37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换 液，每天观察细胞生长情况，3〜4 d传代1次。传代操 作如下：弃去培养基，P B S3〜4 m l清洗2次，加入胰酶 1〜2 m l，置于培养箱中消化1〜2 m i n，倒置显微镜下 观察，若细胞大部分变圆分散，则在培养瓶中加入与胰 酶等量含10%胎牛血清的D M E M完全培养基终止消 化，收集细胞后离心弃上清，以1:3比例传代，取处于 对数生长期的细胞进行实验。
1.2.3 N A F L D细胞造模及分组：取合适数量的对数 生长期H e p G2细胞接种于孔板中，分为4组：对照组 (B S A组）、模型组（F F A组）、二甲双胍低浓度组（M e
L组）、二甲双胍高浓度组（Met H组）。隔夜观察细胞 生长状态良好，进行药物干预。二甲双胍先用去离子 水配置500 m m〇l/L母液，-2C保存。Met L 组和
大连商检局10
20
40
SO
二甲双胍浓度（_ol/L )
图1不同浓度的二甲双胍对H epG 2细胞活力的影响
2.2 各组
H e p G 2
细胞
E R S
兴宁市技工学校相关蛋白表达比较 W e s t e m -b l o t 结果显示，与B S A 组比较，F F
A
组
P E R K
磷酸化程度明显升高（M P
= 3. 23/0. 02)；与F F A 组 比较，M e t L 组和
M e t H 组
P E R K
磷酸化程度降低
(F /P = 70. 310/0. 000)；与 M e t L 组比较，Met H 组
P E R K
磷酸化程度降低更明显（i/P = 6. 402/0. 000)，
见图2。
B S A ©
FFAII
Met LiB
Met. H 组
p-PERK
| ■
一
p e r k
mmamm
G A A G T C
—。目的基因扩增用A
A C T
法计算，A = C T
(目的基因，实验样本）-C T
(内标基因，实验样本），
B =
C T
(目的基因，对照样本）-C T
(内标基因，对照
样本），K = A -B
，表达倍数=2-K 。
1. 4 统计学方法米用 G raphPad P r i s m 8. 0. 1、Image J
统计软件处理数据。每组实验都至少重复3次，取 其平均值。符合正态分布的计量资料以均数±标准差
(±〇表示，多组比较采用单因素方差分析（人^)-
V A
)，P <0. 05为差异有统计学意义。
2结果
2. 1二甲双胍对H e p G 2细胞活力的影响采用不同 浓度（0、10、20、40、80瓜1^1几）二甲双胍干预^^(；2 细胞24 h 后，检测细胞活力，结果显示，相同时间范围 内，不同浓度的二甲双胍对H e p G 2细胞活力的抑制随 剂量升高而增强，差异均有统计学意义（F /P = 1 759.000/0. 000)，见图 1。
1.0 - r ^.
图2各组P E R K 磷酸化程度比较
M e
t H
组分别米用二甲双胍1、0 m m 〇l /L 终浓度进行
预处理1 h ，然后F F A 、M e
t L 、M e t H
组分别加入等量
F F A
进行干预，使
F F A
作用浓度为1 m m o l /L ，B S A 组
加入与F F A 等量的B S A ，作用24 h 后结束N A F L D
细
胞造模及药物处理进行其他检测。
1.3观察指标与方法
1.3. 1 C C
K 8法检测细胞活性：收集对数生长期的
H e p G 2细胞，以5 000/孔的密度接种于96孔板中，每
孔含10%F B S 的D M E M 培养基100 |x 1，在细胞培养箱 中孵育24 h 后，用
P B S
清洗1遍加入新的培养基100
4，并分别以0、10、20、40、80瓜1^1/[浓度的麗61处理 细胞，空白对照组加入等体积的D M E M
完全培养基，
放回孵育箱中继续培养24 h 。弃去原培养基，每孔加
入100 (x l 无血清D
M E M
培养基和C
C K -8试剂10 |x 1，
于37°C 恒温箱中避光孵育1.5 h ，酶标仪测定450 n m 处的吸光度（O D )值，根据公式计算细胞活力。细胞活 力=[(干预组O D
值-空白组
O D
值)/(对照组O D
值-空白组O D
值）]X 100%。
1. 3. 2
Western -blot 法检测蛋白表达：取对数生长期
细胞接种于6孔板中，每孔加入D M E M
2 m l 完全培养
基37°C 恒温箱中培养。细胞分组加入药物干预24 h
后，P
B S
洗涤3遍。按照
R I P A
：
磷酸酶抑制剂：
P M
S F = 100: 2: 1配置裂解液，每孔加入配置好的裂解
液100 X ，冰上裂解1 m i n ，用细胞刮刀收集细胞进行 超声裂解，然后于4C 离心取上清加入loading b uff er ,
100°C 煮沸10 m i n 。B
C A
蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓
度，根据测得浓度调整上样量。将蛋白样品加人十二 烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，后经电泳、转膜，
将转膜结束后的P V D F 膜取出，转人含5%脱脂奶粉 的T B
S T
中封闭60 m i n 。分别孵一抗，稀释比1
1 000,4°C 过夜，回收一抗，加入T B S T
洗涤5次，每次
10 1^，二抗稀释比1:2 550，室温孵育111，用丁831洗
膜3次，每次1 m i n 。用E
C L
化学发光液浸润1 m i n ，
于凝胶成像系统中扫描成像。
1.3.3 q R T -P C
R 实验检测A T F 4基因表达水平：细胞
接种及分组同上，培养24 h 后，收集细胞提取总R N A
，
计算出R
N A
浓度，按试剂盒操作说明合成CD
N A
，并
进行聚合酶链反应（P
C R )检测A T F 4表达水平，以 G A T O H 为内参。q R T -P C R 实验条件为95 C 3 m i n 预
变性，95 C 10 s 、58 C 30 s 、72 C 30 s 重复 40 个循
环。A T F 4 正向引物为 5
—T C
C T G T C C T C C A C T C - C A G A T C -3 ' 反向弓丨物为 5 :T G G G C T C A T A C A G A T G C -
C A C T -3、G A P
D H 正向引物为 5〃-CATCATCC C T G C C T C - T A C T G G -3 ' 反向弓| 物为 5 -T G G G T G T C G C T G T T -M 3d /M 3d
k
BSA FFA Met L Met H
图3各组A TF 4蛋白表达比较
2. 3
各组H e p G 2细胞A T F 4 m
R N A
表达比较通过
q R T -P C R 检测，与B S A 组比较，F F A 组A T F 4 m
R N A
水
平明显增高（*//3 = 13.730/0.000)；与『[人组比较，
M e t L 组和M e t H 组A T F 4 m R N A
表达水平均降低（F /
P
= 66. 960/0. 000)；与 M e t L 组比较，M et H 组 A T F 4
m R N A
表达水平降低（/P = 3. 511/0. 048)，见图4。
BSA FFA Met L Met H
图4各组Hep G 2细胞A T F 4 m R N A 表达比较
2.4各组H e p G 2细胞内自嗟水平比较通过W e s t
ern -blot 法检测各组细胞中 自嗟相关蛋白 P 62 和 L C 3- n / I
的表达情况，与
B S A
组比较，F
F A
组P62蛋白表 达升高（/P = 16.190/0.000)，L C 3-n / I 表达降低（/
P
= 17. 980/0.000)，差异有统计学意义（P < 0. 05 )与 F F A
组比较，M et L 组和M et H 组细胞P 62蛋白显著
Western-blot 结果显示，与B S A 组比较，F
F A
组 A T F 4
蛋白表达水平明显升高（/P =47. 20/0. 000);
与F F A 组比较，Met L 组和Met H 组A T F 4表达水平降 低（F /P = 995. 600/0. 000)；与 Met L 组比较，Met H 组
A T F 4
表达水平降低更明显（/P = 25. 590/0. 000)，
苏教版教材插图见图3。
BSAII
FFA 组一 Met L 组 Met H .组
AXF4cafdh
降低（尸斤=106.700/0.000)，而细胞内^：3-11/1蛋 白比例显著升高（F /P = 166. 400/0. 000)。且与M et L 组比较，Met H 组
L C 3-I I /I
蛋白比例升高（/
P
=
3.474/0.028)，见图 5。
r ，a 〇
BSA 组
FFA 组
Met
IM
Met H 组
p 〇Z
e-r图一
LC3-
I
LC3-II GAPDH
3讨论
二甲双胍属于双胍类药物，是目前临床首选降糖
药，主要通过减少肝脏葡萄糖的输出和改善外周胰岛
素抵抗而降低血糖[9]。有研究表明[1/，二甲双胍在高 脂饮食诱导的小鼠中可明显降低凋亡水平，说明
二甲 双胍具有非酒精性脂肪性肝病的潜力。为进一步 探讨二甲双胍作用于非酒精性脂肪性肝病的体外作用 机制，应用C C K 8法检测二甲双胍对人肝癌细胞
H e p G 2
细胞活力的影响。本结果筛选出对细胞影响
最小的浓度范围，选择1、0 m m o l /L 的二甲双胍进行 后续实验，结果显示，二甲双胍可剂量依赖性地降低
H e p G 2细胞活力，与G u o 等[11]研究结果一致。
研究表明，F F A 可引起肝细胞内脂质蓄积，E R
S
水
H Q d v o /S I
V
平升高[1244]。E R S是指由于细胞受到外界刺激或自 身某些变化因素导致内质网稳态失衡，进而未折叠或 错误折叠的蛋白质累积在内质网内对细胞产生毒性，引发内质网发生非折叠蛋白质应答（unfolded protein reSp〇nSe，U P R)，进而消除和避免未折叠蛋白质的进一 步积累，从而维持细胞稳态。E R S有3条经典的信号 通路:P E R K、I R E l a和A T F6，当E R S被激活时，这3 种蛋白分别活化并进一步激活下游的信号分子传递信 号[15—16]。其中P E R K通路被证实参与N A F L D的发生 发展机制[17]，在本实验中，进一步证实其下游信号分 子A T F4参与F F A建造的N A F L D细胞模型的疾病发 展机制。P E R K通过自身磷酸化被激活，进一步磷酸 化eIF2a，然后A T F4水平上升进而调节细胞代谢。自嗟存在3种不同类型，分别为巨自嗟、微自嗟及分子伴 侣介导的自暖（chaperone-mediated autophagy,C M A)。广义自嗟多指巨自嗟，指在细胞内形成包裹部分细胞 老化细胞器或碎片的双膜囊泡，即自嗟体，自嗟体与溶 酶体结合使其包裹内物质降解，是细胞自我消化的一 种方式[1819]。S o g等[20]研究表明，E R S下游P E R K信 号通路参与诱导自嗟，但本研究中F F A组诱导E R S P E R K信号通路激活且下游A T F4同样被激活，与B S A 组比较，L C3-II/ I比值降低，自嗟水平降低。L C3有 L C3 I和L C3 I I 2种分子形式，发生自嗟时，溶质形式 的L C3 I与磷脂酰乙醇胺缀合形成L C3 II，随后被募 集到自嗟体膜中，是自嗟的特异性标志[21]。最近的研 究表明[2]，高脂饮食喂养建造的N A F L D小鼠模型中，自嗟水平降低，在体外实验中也证明棕榈酸干预会使 自嗟
通量受阻，与本研究结果一致。E R S与自嗟之间 的相互作用在不同的疾病或模型中有所不同，在 N A F L D模型中，多出现E R S水平上升及自嗟受阻。
本研究也进一步证实了二甲双胍在N A F L D模型 中对E R S的影响，这与邙邱等™研究一致，二甲双 胍可降低癫痫持续状态（status epilepticus,S E)诱导的 E R S水平，通过P E R K-eIF2a-C/E B P同源蛋白（C/ EBP-homologous protein，C H O P/G A D D153)信号通路 可直接减少S E模型中的凋亡水平。在N A F L D模型 中二甲双胍也可影响E R S P E R K信号通路，且在本实 验中进一步说明其下游分子A T F4也受二甲双胍调 控。无论在何种细胞内，二甲双胍均可激活腺苷酸活 化蛋白激酶，A M P K作为一种已知的细胞代谢传感器，参与细胞内多种信号传导通路调节[2]。哺乳动物雷帕霉素革巴蛋白（m a m m a l i a n target of rapamycin，m T O R)是自噬调节的重要信号分子，而a m p k的激活可抑制 m T O R[5]。H u等[2]研究表明，二甲双胍可调控m T O R 信号通路，而m T O R信号通路也可进一步负调控自 噬。本实验证实，二甲双胍组可明显增加因F F A降低 的L C3-I I/I比值，且自噬相关蛋白P62水平明显降 低，说明二甲双胍可恢复因F F A脂毒性降低的自噬水 平，可能有助于进一步减少细胞内脂质蓄积。
综上所述，二甲双胍可有效保护肝细胞免受F F A
的脂毒性，缓解其E R S并增强自噬水平，对N A F L D有 潜在的作用。
利益冲突：所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
吴晓曼、张敏：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；田甜、李明：分析试验数据，论文审核；廖星晨：资料搜集整理；谭 诗云：课题设计，论文终审
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