学报
Journal of China Pharmaceutical University2021，52（2）：227-235
227马赛替尼通过抑制自噬和细胞凋亡减轻脑缺血/再灌注损伤
王燕1#，平锋锋2#，周丹丽1，陈艳华1，凌菁菁1*
（1南京医科大学附属无锡市儿童医院药学部，无锡214023；2南京医科大学附属无锡市人民医院生殖医学科，无锡214023）摘要观察马赛替尼对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用并探讨其机制。雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组、马 赛替尼低、中、高剂量组，每组12只。线栓法制备大鼠大脑中动脉梗阻2h后复灌模型，即刻给药，每天给药两次，连续7d。再灌注7d后行神经功能症状缺损评分，检测脑梗死体积及脑含水量，Western blot和PCR检测损伤周围脑组织自噬和凋亡相关蛋白和基因的表达。术后7d，与模型组相比，各给药组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积和脑积水均明显降低。模型组大鼠脑组织中明显上升，p62的表达明显下降。马赛替尼各组均能不同程度地下调LC3II/I、Beclin-1、Bax等凋亡蛋白和NF-κB的表达，上调p62的表达。马赛替尼发挥神经保护作用的机制之一可能与抑制自噬和细胞凋亡通路有关。关键词马赛替尼；神经保护；脑缺血/再灌注；自噬；NF-κB信号通路
中图分类号R965文献标志码A文章编号1000-5048（2021）02-0227-09
doi：10.11665/j.issn.1000-5048.20210212
引用本文王燕，平锋锋，周丹丽，等.马赛替尼通过抑制自噬和细胞凋亡减轻脑缺血/再灌注损伤［J］.中国药科大学学报，2021，52（2）：227–235.
Cite this article as：WANG Yan，PING Fengfeng，ZHOU Danli，et al.Masitinib alleviated cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting autophagy and apoptosis［J］.J China Pharm Univ，2021，52（2）：227–235.
Masitinib alleviated cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting autoph⁃agy and apoptosis热效率
WANG Yan1#,PING Fengfeng2#,ZHOU Danli1,CHEN Yanhua1,LING Jingjing1*
1Department of Pharmacy,The Affiliated Wuxi Children's Hospital of Nanjing Medical University,Wuxi214023;
2Department of Reproductive Medicine,Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi214023,China
Abstract To investigate the neuroprotective effect and possible mechanism of masitinib on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats,healthy adult male Sprague-Dawley rats were divided into sham group(n=12),model group(n=12),masitinib low dosage group(n=12),masitinib middle dosage group(n=12),and masitinib high dosage group(n=12).All rats was subjected to middle cerebral artery occlusion(MCAO)for two hours and reperfusion except sham group,and received treatment twice per day for7days once reperfusion started.Neuro⁃logical score,infarct volume,and brain water content were detected;some autophagic markers,apoptotic and inflammatory cytokines were evaluated by Western blot and PCR after7d of reperfusion.Treatment with masi⁃tinib significantly ameliorated neurologic deficit,infarct volume and brain water after I/R injury.Masitinib also decreased the ratio of LC3II/I and the expression of Beclin-1and increased the expression of p62in the brain tissues of rats with I/R injury.Furthermore,it could inhibit apoptosis-related proteins and NF-κB expres⁃sion.Masitinib could relieve the cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through inhibiting autophagy and apoptosis.
Key words masitinib;neuroprotection;cerebral ischemia/reperfusion;autophagy;NF-κB signaling pathway
收稿日期2020-09-26*通信作者Tel：*************E-mail：
基金项目无锡市卫生健康委科研资助项目（No.Q202010）；江苏省六大人才高峰资助项目（No.YY-128）；无锡市太湖人才计划高层次人才培养资助项目（No.BJ2020088，BJ2020001）
#王燕和平锋锋为共同第一作者
学报Journal of China Pharmaceutical University2021，52（2）：227-235第52卷This study was supported by the Scientific Research Project of Wuxi Health Commission(No.Q202010);the Six Talent Peak Project of Jiangsu Province(No.YY-128)and Wuxi Taihu Talent Plan Top Talents Project(No.BJ2020088,No.BJ2020001)
#co-first author：WANG Yan and PING Fengfeng contributed equally to this work
脑卒中是一种常见的神经系统疾病，因其具有高发病率、高致残率和高致死率的特点，对人类健康带来极大威胁。缺血性脑卒中是脑卒中的主要类型，占脑卒中患者总数的60%~70%。一项世界卫生组织调查报道，我国脑卒中的发病率居于世界首位，且随着人口老龄化，发病率还在逐年上升［1-2］。
因此，研究缺血性脑卒中的发病机制和损伤后的修复机制，寻能有效改善神经功能，发挥脑保护作用的药物一直是众多神经病学科研工作者为之努力的方向。马赛替尼（masitinib）是一种口服的C-kit抑制剂，C-kit属于Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员，其配体为SCF［3-4］。近年来研究发现，SCF在脑缺血/再灌注（I/R）损伤后，发挥重要的神经保护作用［5-6］。但C-kit是否参与缺血性脑卒中的发病机制尚未见报道。因此，本实验通过线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，灌胃给予不同剂量的马赛替尼，评估马赛替尼缺血性脑卒中的潜力，并对其作用机制进行初步探讨，以期为临床脑卒中的提供有力的实验依据和新的研究思路。
1材料
1.1药品与试剂
马赛替尼（法国AB Science公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，中国医药上海化学试剂公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；全蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；cDNA第一链合成试剂盒、One Step TB Green ™PrimeScript™RT-PCR Kit II（SYBR Green，日本TaKaRa公司）。LC3抗体（美国Santa Cruz公司），Beclin-1、IkB-α、P62、p65、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、caspase8抗体（美国Abcam公司），Bid抗体（美国Proteintech公司），p-IkB-α、cleaved-caspase3、GAP⁃DH抗体（美国CST公司），羊抗兔IgG-HRP（江苏凯基生物技术股份有限公司），其他试剂均为市售分析纯。1.2仪器 陶然经典
Sartorius BT125D电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；5804R型台式冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）；Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（英国Syngene公司）；荧光定量PCR循环仪（美国应用生物系统公司）；2838MCAO栓线（北京沙东生物技术有限公司）。
1.3动物
健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重260~ 280g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（合格证编号：SYXK（苏）2017-0015）。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。
2方法
2.1动物分组和受试药的配制
大鼠适应环境7d后，随机分成伪手术（Sham）组、I/R模型组、马赛替尼低剂量组（18.9mg/kg）、马赛替尼中剂量组（37.8mg/kg）、马赛替尼高剂量组（75.6mg/kg）、依达拉奉（3mg/kg）组，每组12只。
马赛替尼的具体配制方法如下：称取马赛替尼7.56g溶于生理盐水10mL中，配制成756mg/mL 的母液。临用前取母液0.5mL至生理盐水50mL 中，稀释得到7.56mg/mL的高剂量组母液，则高剂量组的给
药体积V（mL）=（75.6mg/kg×大鼠体重（kg））/7.56mg/mL，以此类推，配制好中剂量组和低剂量组的受试药。大鼠缺血2h后再灌注时即刻给药，每天两次，连续给药7d。Sham组和I/R组大鼠灌胃给予等容积生理盐水。实验流程如图1-A所示。
伊斯兰教葬礼2.2MCAO模型的建立
参照Longa法［7］建立大鼠MCAO模型，术前12h 禁食不禁水。大鼠异氟烷麻醉，仰卧位固定于手术台上，颈部备皮，碘伏消毒。取颈部正中切口，小心分离皮下脂肪和肌肉，右侧颈总动脉（com⁃mon carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid
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第52卷第2期王燕，等：马赛替尼通过抑制自噬和细胞凋亡减轻脑缺血/再灌注损伤
artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。用微小动脉夹临时夹闭CCA和ICA，并在CCA远心端备线勿扎紧。分离ECA主干，钝性分离出甲状腺动脉和枕动脉，并电灼切断；剪断后将ECA下拉与ICA成一条直线。在距CCA分叉远端约2mm处用眼科剪作细小斜向切口，将肝素浸泡过的线栓（直径0.26mm）插入，扎紧缝合线，松开ICA动脉夹，慢慢推动线栓进入ICA，使其从ICA入颅动脉支。线栓穿过距ICA和ECA分叉处约2.0cm 有阻力感时，表明线栓已将大脑中动脉堵塞，将备线
扎紧并记录栓塞开始时间。将少量青霉素注射粉针涂于手术伤口，对齐并缝合皮下软组织和皮肤，栓线尾部留于体外。2h后缓慢退出线栓至CCA切口处，恢复MCA区血流供应。术中维持大鼠肛温37℃左右，直至动物苏醒。Sham组的动物只做钝性分离，但不插入线栓，其他操作与手术组相同。
2.3神经功能评分
再灌注7d后，根据Zea Longa的神经功能缺损5分制标准［7］，对实验大鼠进行神经行为功能评分。分数越高，损伤越严重。剔除造模过程中死亡大鼠，以及取材时发现蛛网膜下腔出血的大鼠。
2.4大鼠脑组织含水量的测定
再灌注7d后，异氟烷过量深度麻醉处死大鼠，快速断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，迅速称取脑湿重。然后将脑组织置于110℃干燥箱中烘至恒重，称取脑组织干重。脑组织含水量=（脑组织湿重−脑组织干重）/脑组织湿重×100%。
2.5大鼠脑组织梗死体积的测定
采用TTC染法测定脑组织梗死体积。再灌注7d后，10%水合氯醛过量深度麻醉处死大鼠，快速断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，即刻放入鼠脑专用切片模具中，按2mm的规格冠状切为5片，迅速加入2%TTC染液，避光置于37℃水浴中保温20min，其间每隔7~8分钟上下面翻动一次。根据切
片颜结束染过程，正常脑组织呈玫瑰红，梗死组织呈白。将切片按层面顺序排列整齐并用数码相机拍摄照片后输入电脑，使用Image-Pro Plus6图像分析软件测定大脑健侧半脑面积及梗死侧正常组织面积。梗死面积百分比（%）=［（梗死面积×2mm）/（2×健侧脑面积×2mm）］×100。2.6Western blot检测相关蛋白的表达
再灌注7d后处死动物，取缺血侧脑组织皮质部分，放入预冷的组织裂解液（1∶9），冰浴中进行匀浆，得到的组织匀浆于4℃12000r/min离心20min，取上清液获得总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。加入适当量的蛋白上样缓冲液混匀、离心、变性、上样。每孔加入上样蛋白50µg，SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后进行转膜、封闭。加入一抗后4℃孵育过夜，二抗室温摇床孵育2h。采用ECL 发光试剂显，并经Image J凝胶成像系统进行显影检测。涉及到的一抗包括：LC3（1∶500），Beclin-1（1∶2000），IkB-α（1∶2000），p-IkB-α（1∶2000），P62（1∶3000），p65（1∶2000），Bcl-2（1∶1000），Bcl-xl（1∶1000），Bax（1∶5000），Bid（1∶5000），Bad （1∶2000），caspase8（1∶2000），cleaved-caspase3（1∶1000），GAPDH（1∶1000）；二抗：羊抗兔IgG-HRP（1∶5000）。
2.7RT-PCR检测相关基因的表达
称取各组大鼠脑组织100mg，加Trizol1mL，提取总RNA，定量后取RNA2µg逆转为cDNA，用SYBR
Green进行扩增，采用的循环为：95℃15s，60℃1min，95℃1min，65℃10s，共40个循环。采用GAPDH作为每次扩增过程中的内参，引物的序列见表1。
2.8HE染和TUNEL染
制备脑组织石蜡切片，将组织切片经过梯度乙醇常规脱蜡至水，经苏木精-伊红（HE）染、二甲苯透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察。此外，依据TUNEL试剂盒说明书操作，光学显微镜下观察各组大鼠脑组织凋亡神经元并拍照计数。
2.9统计学处理
采用GraphPad Prism统计软件包进行数据统Table1Sequences of real time PCR primers
玻利瓦尔Gene
GAPDH
p62
NF-κB
IκBα
Primer sequence(5′→3′)
Forward:5′-CGGCAAGTTCAACGGCACAGT-3′
Reverse:5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′
Forward:5′-AGAGCGGGTACTGATCCCTG-3′
Reverse:5′-GTCTCTCATCGAACCCTTCCC-3′
Forward:5′-AGACCTGGAGCAAGCCATTAGC-3′
Reverse:5′-CGCACTGTCACCTGGAAGCA-3′
Forward:5′-GGCATCGTGGAGCACTTGGT-3′
Reverse:5′-ACACTTCAACAGGAGCGAGACC-3′
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学报Journal of China Pharmaceutical University 2021，52（2）：227-235第52卷
计。所有数据采用x ˉ±s 表示，组间比较采用One -
Way ANOVA 检验，P <0.05为差异有统计学意义。3结果
3.1
马赛替尼对I/R 模型大鼠神经功能和脑梗死体外诊断
的影响
Sham 组无明显神经功能损伤。I/R 损伤后，各
组动物表现出不同程度的神经功能障碍，出现强迫体态和对侧前肢偏瘫，爬行时向偏瘫侧转圈、追
尾等相应症状。如图1-B 所示，与Sham 组相比，I/R
组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P <0.001），表明I/R 大鼠造模成功；与I/R 组相比，马赛替尼低、中、高剂量组和依达拉奉组大鼠经过后，神经功能缺损评分均不同程度降低（P <0.05，P <0.001，P <0.001，P <0.001），其中马赛替尼高剂量组效果最突出。
再灌注7d 后，对脑组织进行TTC 染，评估脑梗死的情况。正常脑组织因含有脱氢酶而被染成红，梗死脑组织因细胞膜损伤，导致脱氢酶被完全释放丢失而不被染。如图1-C 和1-D 所示，Sham 组大鼠的脑组织均呈红，
无梗死灶出现；
Figure 1Effects of masitinib on neurological score and infarction after ischemia/reperfusion (I/R)
A:Experimental outline;B:Neurologic deficits were assessed at 7d after reperfusion (x
ˉ±s ,n =12);C:Infarcted brain regions were visualized using TTC staining.Representative examples are shown from each treatment group;D:The ratio of corrected infarct area to whole brain area was calculated
for the cerebral infarct size (x
ˉ±s ,n =6).(E)Brain edema were detected in ischemic cerebral cortex after cerebral I/R in rats (x ˉ±s ,n =6)*
P <0.05vs sham group,**P <0.01,***P <0.001vs sham group;#P <0.05vs model group,##P <0.01vs model group
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第52卷第2期王燕，等：马赛替尼通过抑制自噬和细胞凋亡减轻脑缺血/再灌注损伤
I/R 组和马赛替尼组均出现了不同程度的脑组织梗死。与Sham 组相比，I/R 组大鼠脑梗死体积明显增加（P <0.001）；与I/R 组相比，马赛替尼低、中、高剂量组和依达拉奉组均能够不同程度的降低脑梗死体积（P <0.05，P <0.01，P <0.01，P <0.01），其中马赛替尼高剂量组的降幅最大。
与健侧脑组织相比，缺血侧脑组织出现明显
水肿（图1-E ）。与Sham 组相比，I/R 组大鼠的脑水肿程度显著增加（P <0.01）。给予不同剂量的马赛替尼和依达拉奉后，脑水肿程度均得到了不同程度的减轻（P <0.05，P <0.01，P <0.01，P <0.01）。3.2
马赛替尼对I/R 模型大鼠脑组织损伤的影响
HE 染结果如图2-A 所示：Sham 组大脑皮层
神经元基本正常，核居中，未见神经元明显变性、
坏死及炎细胞浸润等病理学改变。I/R 组大脑皮层神经元均出现重度变性、坏死。神经元数目明显减少，神经元结构模糊、胞体肿胀，尼氏体减少或消失，出现不同程度的核固缩、核溶解。马赛替尼各剂量组和依达拉奉组均能不同程度的减轻神经元损伤，神经元变性、坏死程度明显减轻，炎细胞浸润明显减少。
TUNEL 染结果如图2-B 所示：I/R 损伤可引
起大鼠缺血侧皮层神经元细胞发生凋亡，表现为TUNEL 阳性细胞（棕黄）数量明显增加，Sham 组
大鼠皮层神经元几乎未见TUNEL 阳性细胞。马赛替尼各剂量组和依达拉奉组均能不同程度的减少TUNEL 阳性细胞数量，其中马赛替尼高剂量组作用最明显。结果提示马赛替尼可明显减少I/R 损伤引起的大鼠缺血侧皮层神经元细胞凋亡。
3.3
马赛替尼对I/R 模型大鼠脑组织中自噬水平
的影响
采用Western blot 法检测自噬标记物LC3、
Beclin -1和p62的蛋白水平。结果如图3-A ，3-B 和3-D 所示，I/R 组大鼠脑组织中Beclin -1和LC3-I 的
表达显著升高（P <0.01，P <0.01），且LC3-I 向
LC3-II 的转化增多；p62的表达降低（P <0.01）。与I/R 组相比，马赛替尼中剂量和高剂量组均不同程度地降低了Beclin -1（P <0.05，P <0.01）和LC3-I 的表达，抑制了LC3-I 向LC3-II 的转化（P <0.01，P <0.01）；增加了p62的表达（P <0.01，
P <0.01）。与蛋白表达的变化一致，给予马赛替尼中剂量和高剂量后，p62的mRNA 水平也显著上
三峡天丛
调（P <0.01，P <0.01）（图3-E ）。3.4
马赛替尼对I/R 模型大鼠脑组织中NF -κB 信
号通路的影响
结果如图4所示，与Sham 组相比，I/R 组大鼠脑组织内NF -κB 蛋白和mRNA 的表达明显上调（P <0.0
1，P <0.01）；与I/R 组相比，只有马赛替尼高剂量组显著抑制了I/R 损伤后NF -κB 蛋白和mRNA 表达的上调（P <0.01，P <0.01）。此外，与Sham 组相比，I/R 组大鼠脑组织内IκBα的表达显著降低（P <0.01），而p -IκBα的表达则明显增加（P <0.01）。与I/R 组相比，不同剂量的马赛替尼均能不同程度地逆转I/R 损伤后的上述变化，其中高剂量组作用最显著（P <0.01，P <0.01）
。
Figure 2Effects of masitinib on neuronal injury and apoptosis in ischemic cerebral cortex
A:Cerebral sections were stained with hematoxylin and eosin and examined under light microscope at 7d after reperfusion;B:Representative micropho⁃tographs of TUNEL staining in the ischemic cortex at 7d after perfusion(Scale bar,20µm)
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