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细胞⾃噬的检测⽅法
⾃噬发⽣时，细胞内会形成⼀种称为吞噬泡的⼩囊泡样结构，⾸先与需降解的胞质成分集结在⼀起，然后隔离膜延伸并包裹封闭胞浆成分形成⼀个双层膜的结构即⾃噬体（autophosome），⾃噬体与溶酶体融合形成⾃噬溶酶体（autopholysome），其中包裹的胞质成分最终在溶酶体酶的作⽤下被降解利⽤。 ⽬前，⾃噬的检测⽅法可分为两种∶直接法和间接法。
应力应变直接法指直接观察⾃噬体的形态，例如通过透射电⼦显微镜观察⾃噬性结构的形成是检测⾃噬现象较直接和较经典的⽅法（图1）。
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图1、透射电镜下⾃噬⼩体（单箭头）和⾃噬溶酶体（双箭头）形态
（Noboru, Mizushima et al. Cell, 2010）
间接法通常指通过免疫组织化学、免疫荧光及Westem blot等⽅法对⾃噬体表⾯蛋⽩标记分⼦进⾏检测。 LC3为微管相关蛋⽩1轻链3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3/Atg8），是⾃噬体膜上的标记蛋⽩分⼦。细胞内存在两种形式的LC3蛋⽩∶LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋⽩合成后其C端被Atg4蛋⽩酶切割变成LC3-Ⅰ，LC3-I分布于细胞质内，当⾃噬体形成后，LC3-I和磷脂酰⼄醇胺耦联形成LC3-Ⅱ并定位于⾃噬体内膜和外膜上。与其他定位于⾃噬性结构膜上的Atg蛋⽩不同（仅在⾃噬过程的某⼀阶段发挥作⽤），LC3-Ⅱ始终稳定地保留在⾃噬体膜上，直到与溶酶体融合，因此常被⽤来作为⾃噬体的标记分⼦。
1) GFP-LC3单荧光和mCherry-GFP-LC3双荧光指⽰系统
⾃噬形成时，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋⽩转移⾄⾃噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿⾊或黄⾊荧光斑点。当⾃噬溶酶体形成后，酸性的溶酶体环境使GFP荧光淬灭，⽽mCherry荧光不受影响，⾃噬溶酶体呈现红⾊荧光（图2）。因此，科研⼯作者可以通过LC3荧光指⽰系统来监测⾃噬流。
pvod图2、 LC3⾃噬双标系统追踪⾃噬流不同阶段
（Hansen T E, Johansen T. BMC Biology, 2011）
2) Western Blot检测LC3和p62蛋⽩的表达量
①利⽤Western Blot检测LC3-II/I⽐值的变化以评价⾃噬形成（如图3）。⾃噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉⼀⼩段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。因此可以通过LC3-II/I⽐值的⼤⼩估计⾃噬⽔平的⾼低。
图3、WB检测LC3、p62蛋⽩的表达
（Yoshii, S.R. and N. Mizushima. Int J Mol Sci, 2017.）
唐园结
②除LC3外，其他⾃噬底物表达量的变化也可以⽤于监测⾃噬流。其中，p62是研究⼴泛的⼀个⾃噬底物。p62（也称为SQSTM1蛋⽩），由以下三个结构域组成：N端Phox和Bem1 (PB1)结构域、锌指结构域和C端泛素相关(UBA)结构域。研究表明，p62蛋⽩锌指结构域和UBA结构域之间的连接区域（LRS区域）负责与⾃噬受体蛋⽩Atg8/LC3结合，UBA结构域负责招募泛素化蛋⽩。在⾃噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋⽩之间的桥梁，被选择性地包裹进⾃噬体，之后被⾃噬溶酶体中的蛋⽩⽔解酶将其降解（图4），所以p62蛋⽩的表达量与⾃噬活性呈现负相关。因此，利⽤Western Blot检测p62蛋⽩的表达量也可以⽤来评价⾃噬⽔平（图3）。图4. p62介导的选择性⾃噬模型（Ichimura Y et al. J Biol Chem, 2008）
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