现代生物医学biomedjournals Progress in Modern Biomedicine V〇L20 N C X22 NOV.2020• 4207 •doi: 10.13241/jki.pmb.2020.22.002
人PINKl-shRNA载体的构建及对神经母细胞瘤细胞线粒体的影响* 许明阳王淑艳马浩洁刘燕于雪冯婧郭振宇张淑静△胡京红&
(北京中医药大学中医学院北京102488)
摘要目的：构建筛选人源靶向特异PINKl-shRNA敲减质粒，转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率，观察对细胞线粒体形态的影响方法：构建两对人源PINKl-shRNA序列（编号分别为PIN ia-shR N A-39和PINKl-shRNA-42)，将这2对干扰序列连接在载体上形成重组栽体，经测序验证后，将空栽体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y 细胞，获得基因敲减的细胞模型，用C CK-8法检测细胞的存活率，用荧光定量P C R方法确定PIN K1基因的敲减效率，用蛋白质 免疫印迹法验证细胞内PIN K1的表达水平是否发生改变，用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变。结果：我们提 取的质粒，经测序结果显示，质粒载体构建成功；转染细胞后，C C K-8法检测细胞存活率发生了降低，与正常组比较，PINKl-shRNA-39和PINKl-shRNA-42敲减质粒组，细胞的存活率分别降低了 13.7%(P<0.05)和14.1%(P<0.05)；荧光定量 PC R结果显示，与正常组相比，PINKl-shRNA-39组和PINKl-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PIN K1基因的表达分别降低 了24.1%(P<0.01)和36.7%(P<0.0 1)；蛋白质印迹法结果显示，与正常组相比，两对质粒分别转染细胞后，PIN K l-shR NA-39和PINKl-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01),P IN K l-shR N A-42敲减质粒 转染的细胞内PIN K1蛋白的表达水平有效降低更明显；与正常组比较，激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部 分发生断裂，碎片较多，基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：成功构建了人源的 PINK1基因敲减的质粒，并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y细胞中，细胞内PIN K1基因的m R N A和蛋白的表达水平降低，且 细胞线粒体的形态发生了改变，
关键词：PIN K1基因shR N A质粒;SH-SY5Y细胞；线粒体功能障碍；帕金森病
中图分类号:Q95-3 ;Q78; R742.5 文献标识码：A 文章编号：1673-6273( 2020 )22-4207-06
Construction of Human PINKl-shRNA Vector and Its Effect
on Mitochondria of Neuroblastoma Cell*
XUM ing-yang, WANG Shu-yan, MA Hao-jie, LIU Yan, YU Xue, FENG Jing, GUO Zhen-yu, ZHANG Shu-jing^, H U Jing-hong^ (School o f Traditional Chinese Medicine, Beijing University o f C hinese Medicine, Beijing, 102488, China) ABSTRACT Objective:To construct and screen the human targetin
g specific PINKl-shRNA knockdown plasmid, transfect SH-SY5Y cells and verify the knockdown efficiency of PINK 1gene after transfection, and observe the effect on the morphology o f cell mitochondria. Methods:Two pairs o f human PINKl-shRNA sequences (numbered PINKl-shRNA-39 and PINKl-shRNA-42) were constructed, and the two pairs o f interference sequences were connected to the vector to form a recombinant vector. After sequencing, the empty vector and tA vo pairs o f knockdown plasmids were transfected into SH-SY5Y cells, respectively, and the cell model o f gene knockdown was obtained. The cell survival rate was detected by CCK-8 method, and the knockout efficiency o f PINK 1gene was determined by fluorescence quantitative PCR. Western blotting was used to verify whether the expression level o f PINK1 in cells changed, and laser confocal microscope was used to observe whether the morphology o f mitochondria changed. Results:The sequencing results o f the plasmid we extracted showed that the plasmid vector was successfully constructed. After transfection, the cell survival rate was decreased by CCK8 assay. Compared with the normal group, the cell survival rate o f PINKl-shRNA-39 and PINKl-shRNA-42 knockdown plasmids groups decreased by 13.7 %(P<0.05) and 14.1 %(P<0.05), respectively. The results of fluorescence quantitative PCR showed that compared with the normal group, the expression of PINK1 gene in the cells transfected with PINKl-shRNA-39 and PINKl-shRNA-42 knockdown plasmids decreased by 24.1 % (P<0.01) and 36.7 % (P<0.01), respectively. The results
o f Western blotting showed that compared with the normal group, the expression level of PINK1 protein in the cells transfected with PINKl-shRNA39 and PINKl-shRNA-42 knockdown plasmid decreased significantly after the two pairs of plasmids were transfected respectively, and the expression level o f PINK1 protein in the cells transfected with PINKl-shRNA-42 knockdown plasmid was more significantly lower than that in the normal
*基金项目：中央高校基本科研业务费自主选题(2019-XJ-SYJJ-010; 2015-JYB-JSMSO19)
作者简介：许明阳（1994-)，女，助理实验师，主要研究方向：中药新药研发，E-mail:***********************
△通讯作者：张淑静，女，高级实验师，主要研究方向：细胞培养与细胞生物学技术研究，E-mail:*************************;
胡京红，女，高级实验师，主要研究方向：细胞培养与细胞生物学技术研究，E-mail:**************
(收稿日期：2020-03-27接受日期:2020-04-22)
group.Com pared with the norm al group,the m itochondrial part of the cells in the gene knockout group was broken and m ore fragm ents were observed by laser confocal microscope,the m itochon
drial morphology factors of the two knockdown groups were significantly reduced,and the difference was statistically significant(P<0.01). Conclusion: The hum an PINK1gene knockdown plasmid was constructed successfully,and the knockdown plasmid was successfully transfected into SH-SY5Y cells,and the mRNA and protein expression levels of PrNKl gene in SH-SY5Y cells were decreased,and the morphology of mitochondria changed.
Keywords: PINK1gene shRNA plasmid;SH-SY5Y cells;M itochondrial dysfunction;Parkinson's disease
Chinese Library Classification(CLC): Q95-3; Q78; R742.5 Document code: A
Article E D: 1673-6273(2020)22-4207-06
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前言
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种神经退行性疾病，其临床症状与黑质致密部中多巴胺能神经元的丧失有关。有研 究表明，氧化应激、线粒体功能缺陷、蛋白过量表达和聚集、炎 症等在黑质多巴胺能神经元变性死亡中均参与了致病过程，但 究竟这些因素是如何被介导以致引起上述变化并最终
影响多 巴胺神经元的生存状态仍不清楚
目前已确定的与P D相关易感基因有PINKl、Parkin、DJ-l、alpha-synuclein等其中PINK1是帕金森病发病的关 键基因之一,PINK1具有明确的激酶结构域和线粒体靶向序 列，突变后可引起线粒体形态及功能异常，引起隐形遗传性帕 金森病的发生,PINK1基因的敲除会导致受损蛋白质稳态异 常，线粒体功能受损M,PINK1在线粒体质量控制中起着至关 重要的作用，可以通过调节PINK1的表达来改善线粒体功能 是一种有效对抗PD的神经保护策略，但这些功能异常产生的 详细的分子生物学机制仍有待进一步阐明。因此，本实验我们 构建PINK1基因敲减的质粒，通过转染SH-SY5Y细胞，构建 PINK1敲减的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，建立帕金森病的细胞模型，观察细胞模型内线粒体形态的变化。
1材料与方法
1.1材料与试剂
Lipofectamine® 3000脂质体购置上海英俊公司；SH-SY5Y 细胞购自上海吉凯基因有限公司；LB培养基购置北京鼎国昌 盛有限公司，DMEM培养基(hyclone)、胎牛血清(0加〇)，0?-ti-M EM (Invitrogen)、CCK-8试剂盒购置上海碧云天生物技术 有限公司；胰蛋白酶(Invitrogen)，质粒大提试剂盒购置美国Qi-agen公司，质粒测序(北京鼎国昌盛有限公司）。TRIzol试剂购 自上海英俊公司，反转录试剂盒购自赛默飞，Power SYBR® G reen PCR M aster Mix购自ABI公司，弓丨物设计应用Prim e
r5软件设计，由上海英俊公司合成，组织蛋白裂解缓冲液、电泳缓 冲液，电转缓冲液等试剂购置北京普利莱基因技术有限公司，兔源抗PINK1抗体、内参以及二抗购自武汉Proteintech公司；M itoTracker® Red CMXRos (MTR)购置美国 Life technologies 公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。
艾普拉唑
引物设计与合成：应用Prim er5软件设计PINK1及内参基 因ACTIN的引物，交由上海英俊公司北京合成部合成(附表1)。
表1验证PINK1 m RNA敲减效率用引物以及内参序列
Table 1Primers' sequences used to verify PINK1 mRNA knockout efficiency
Primer Name Primer Sequence
PINK 1 -F GGCTTGGCAAATGGAAGAAC PINK 1 -R CTCAGTCCAGCCTCATCTACTA ACTIN-F CGGCTACAGCTTCACCACCA ACTIN-R CGGGCAGCTCGTAGCTCTTC Temperature
60 °C
60 °C
Note: PINK1-F and PINK1-R are the upstream and downstream primers for verifying the PINK1 mRNA knockdown efficiency, while ACTIN-F and ACTIN-R are upstream and downstream primers for internal reference genes.
1.2方法
2000年奥运会男篮1.2.丨质粒的构建、提取与测序通过PUBMED数据库(http: //bi.v/pubmed/)，查询人源 PINKI 基因的基因 编号(NM_032409)，交由上海吉凯基因公司构建EG FP-PINK1敲减质粒和空载质粒。我们将构建的质粒转染感受态细菌中，移取适量菌液，用无菌涂布棒轻轻地涂布在含有氨苄霉素的 LB固体培养基上，在电热恒温培养箱中正置5-10 min后再倒 置培养15 h，然后挑选单个菌落接种于LB液体培养基中，放 置37 °C摇床上,220 rpm恒温振荡培养15 h，按照Qiagen质粒 大提试剂盒的实验步骤提取质粒，将提取的质粒交由北京鼎国 昌盛公司对其进行测序鉴定。
1.2.2SH-SY5Y细胞培养、实验分组 解冻SH-SY5Y细胞株，培养至细胞密度达到90%时，即可进行传代培养。待培养的 SH-SY5Y细胞达到对数生长期时，用胰蛋白酶消化制成细胞 悬液，将细胞约为6x104接种于6〇11培养皿,37’(：、5%的C02培养箱，待细胞融合度达到约70%，用Lipofectamine® 3000脂质体将质粒转染SH-SY5Y细胞，感染后继续培养24 h 后，更换培养基，感染3天后用倒置荧光显微镜观察细胞转染 效果。本实验分为四组，正常组(不做处理）、空载体组(转染空 栽体>、PINKl-s
hRNA-39 敲减组（转染 PINKl-shRNA-39 敲减 质粒）和PINK丨-shRNA-42敲减组（转染PINKJ-shRNA-42敲减质粒）；每组细胞分别做3个复孔，当荧光率大于60 %时，即可以进行后续实验，收集细胞用于PINK1基因的RNA和蛋白 表达量的检测实验，以及使用激光共聚焦显微镜观察线粒体的
现代生物医学进展biomedcnjoumals Progress in Modem Biomedicine V〇L20 NCK22NOV.2020• 4209 •
形态。
1.2.3CCK-8法检测细胞的存活率严格按照碧云天试剂盒 步骤操作：实验分为四个组，正常组不做处理，其余各组分别转 染空载体或敲减质粒后，37°C、5 %的C02培养箱培养24 h后 检测，设置空白组（没有细胞)加人〗〇〇M X DMEM培养液，其 余各组加人10 j j l L的COC-8溶液+90 j j l L DMEM培养液，37 °C、5 %的C02培养箱中培养1h后，用酶标仪450 nm测定 吸光度(OD值)。计算细胞相对存活率(RSR，Relative Survival Rate)=(实验组OD-空白组OD)/(正常组OD-空白组OD)x 100%〇
1.2.4q-RT-PCR检测 SH-SY5Y细胞中 PINKl 基因 mRNA 的表达水平敲减质粒感染SH-SY5Y细胞后72小时，待质粒 的作用进人下游，细胞个数为l x 1〇6个，应用Trizol裂解液裂 解细胞提取总RNA。人的PINK1和ACTIN的引物由上海生工 合成，见附表1。实时荧光定量PCR的反应体系为20 j j l L：其中 上、下游引物（浓度10 j j l M)各为0.4 (xL，反转录C DNA样品 2 pL (原液 10 倍稀释）、PowerSYBR
® Green PCR M aster M ix 10 jjL L、ddH207.2 pX，荧光定量PCR反应条件如下:95 °C预变 性10 min;40个扩增循环:95 °C变性5 s,60 °C退火30 s，并读 取荧光数值；随后进行溶解曲线的扩增，反应条件如下：95 'C, 15 s,60 °C,1min，并读取荧光数值,95 °C,15 s结束。应用软件 实时读取的Ct值，计算每个样本的ACt值(C t目的基因-Ct内参)、每个样本的A A C t值(ACt处理组-ACt对照组)，并计算 样品的相对表达量(RQ,Relative Qualification)=2-_值，并对 实验结果进行统计学分析。
1.2.5WB检测SH-SY5Y细胞中PINK1蛋白的表达提取细胞的总蛋白，用BCA法蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度。每 个组取等量的蛋白进行凝胶电泳，120 v,90 min；转膜用80 V, 70 min，5 %脱脂奶粉室温封闭1h。用0.5 %的牛奶/TBST稀释一抗(1:1〇〇〇)，室温孵育1h，4-C摇床过夜。第二天，室温孵育 二抗l h，TBST洗3次，10 min/次，化学发光显影，用美国 Azure超灵敏多功能成像系统分析条带，并得出灰度值。蛋白相 对表达量(RPE,Relative Protein Expression)=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。
1.2.6共聚焦显微镜观察活细胞的形态，并用软件分析线粒体的形态因子细胞处理同前面操作，预热无抗生素的培养基 和PBS，配制含 M itoTracker® RedCMXRos(M TR)的无抗生素 培养基，浓度为100 nM。吸出旧培养基，加人含MTR的培养 基，孵育15 min。PBS洗2次，加人新鲜的PBS，使用共聚焦显 微镜观察每个实验分组的细胞，并选取六个视野进行拍照(物 镜6〇x，发射波长603 nm，激发波长559 mn)，应用Im ageJ (Version 1.48,N1H)根据图像特征对原始图像进行去背景、锐 化和二值化处理，
分析线粒体形态参数，形态因子（FF，Form factor)=周长 2/(4t t>< 面积)。
1.3统计学分析
lancet
应用软件Image]对激光共聚焦图像进行分析；应用软件 SPSS17.0统计分析所有实验数据，数据以均数±标准差(;c± s)表示，多组间差异比较采用方差分析和非参数检验(M ann-Whitney、K L r u sk a l-Wallis),P<0.05 差异具有统计学意义，每项实验至少三次生物学重复。2结果
2.1提取质粒测序结果
DNA测序结果显示，我们构建的质粒序列与设计的 shRNA质粒序列完全一致，提示构建的质粒载体成功，见图1。
A PINK I -shRNA-3^ sequencing result
图1PINKl-shRNA测序结果
Fig. 1PINK 1 -shRNA sequencing results
A: PINKl-shRNA-39 的测序结果B: PINKl-shRNA-42 的测序结果 A: PINKl-shRNA-39 sequencing result B: PINKl-shRNA-42 sequencing
result
2.2细胞培养状态与质粒转染效率观察
细胞正常培养状态下，细胞形态结构正常、完整；质粒转染 细胞后，通过倒置荧光显微镜观察SH-SY5Y细胞内绿荧光 蛋白(G FP)的表达，结果显示，正常组细胞内未观测荧光蛋白 的表达，空载体组和两个基因敲减组细胞内有较多的绿荧光 蛋白表达，见图2。
Mri说hi field observation Muorcsccncc IlcW obsenation
Objective lcn；> 20 *Objective len* 20 *
图2S H-S Y5Y细胞的培养状态观测(物镜2〇x }
Fig.2 Observation of the culture state of the SH-SY5Y cells
(Objective 20 x
)
• 4210 •
NG
ECG shRNA-39 shRNA-42
图4 PINK1基因m RNA 在SH-SY5Y 细胞中的相对表达情况
Fig.4 The relative expression of PINK 1 mRNA in SH-SY5Y cells Note: NG: normal group;ECG:Empty carrier group;shRNA-39: PINK1-shRNA-39 group; shRNA-42: PINK 1-shRNA-42 group.
PINK I
Actin
shRNA-39 shRNA-42
ECG
NG
5A
化学发光显影，超灵敏多功能成像系统W estern Blot 实验 的结果如5A ；用成像系统分析WB 实验的灰度值，结果显示， 与正常组相比，PINKl -shRNA -39组和PINKl -shRNA -42组细 胞内P 1NK 1蛋白的表达降低(/><0.01)，空载体组PINK 1蛋白 的表达，未有显著降低，结果见图5B 。
2.3细胞存活率的检测结果
C C K -8法检测细胞存活率结果显示，与正常组比较, PINKl-shRNA-39和PINKl-shRNA-42敲减质粒转染细胞后，
细胞内的存活率分别降低了 13.7%(P <0.05)和14.1 %(/><
0.05)；空载体组与正常组比较，表达水平变化没有明显的差
异。结果见表2和图3。
表2细胞相对存活(r f x;N=3)
Table 2 Relative cells survival (x± 5； N=3)Groups (N =3)Relative survival rate( x± s )
Normal group 1.000± 0.0523Empty carrier group 0.930± 0.0554PINK 1-shRNA-39 group 0.863± 0.0684*PINK 1-shRNA-42 group
0.858± 0.0937*
Note: Compared with the normal control group, *P<0.05; **/5<0.01.
U . 1/
|
| | I
NG ECG shRNA-39 shRNA-42
图3各组细胞相对存活率
Fig.3 Relative survival rate of cells in each group Note: NG: Normal group; ECG:Empty carrier group;个体工商户税收定期定额征收管理办法
shRNA-39: PINK 1-shRNA-39 group; shRNA-42: PINK 1-shRNA-42 group.
2.4转染SH -SY5Y 细胞后P IN K l 基因的m R N A 表达情况
荧光定量P C R 结果显示，与正常组比较，PINK1-
shRNA-39组和PlN K l-shR NA -42组敲减质粒转染细胞后，细
胞内PINK1基因的表达分别降低了 24.1 %(P <0.01)和36.7 %(P <0.01)；空载体组与正常组比较，表达水平变化没有明显 的差异。结果见表3和图4。
表3 PINK1基因的相对表达量(x± S;N=3)
Table 3 The relative expression of PINK 1 genes (^± 5； N=3)
Groups (N =3)Relative expression(x± s)
Normal group 1.031± 0.1429Empty carrier group 0.970土 0.1213PINK 1-shRNA-39 group 0.783±
0.1094**PINK 1-shRNA-42 group
0.653± 0.0533**
Note: Compared with the normal control group, *^<0.05; **P<0.01.
2.5蛋白免疫印迹法检测转染后SH -SY5Y 细胞内PIN K 1蛋白
的表达水平
0. 〇J ~~ry -1 I N ^I J —NG ECG shRNA-39 shRNA-42图5 PINK1蛋白在SH-SY5Y 细胞中的表达情况
Fig.5 Expression of PINK 1 protein in SH-SY5Y cells
A: The results of Western Blot experiment of supersensitive multi-function
imaging system
B: Analysis of grayscale value of WB experiment with imaging system Note: NG: Normal group; ECG: Empty carrier group; shRNA-39: PINK 1-shRNA-39 group; shRNA-42: PINK 1-shRNA-42 grou
p.
2.6激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态，用软件分析线粒体
的形态因子
用MitoTracker® Red CMXRos(MTR)探针标记线粒体后， 在激光共聚焦显微镜下，观察线粒体的形态，正常组和空载体
组的SH -SY5Y 细胞形态饱满，细胞数量较多，细胞核较清晰，
PINKl-shRNA-39和PINKl-shRNA-42基因敲减组的细胞死亡
增加，荧光强度减弱，提示线粒体断裂，碎片较多，见图6。应用
Im age ]软件分析线粒体形态参数，统计结果显示，与正常组相
比，基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低(P <〇.〇 1)，见图7。
现代生物医学进展 biomecLcnjournals Progress in Modern Biomedicine V 〇L20 N0^2 NOV^020
远华案件
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0•0•
NG
ECG shRNA-39 shRNA-42
图7 Image *!软件分析各组细胞线粒体形态因子
Fig. 7 Analysis of mitochondrial morphological factors of cells in each
group by ImageJ software
Note: NG: Normal group;ECG:Empty carrier group;shRNA-39: PINK 1-shRNA-39 group; shRNA-42: PINK 1-shRNA-42 group.
3讨论
目前对帕金森病的主要以药物为主，中医药在治 疗帕金森病过程中，根据每个人体质辨证论治、随证加减，因此 中西医结合帕金森病有巨大的发展空间110'"1，有实验研究 表明，中药三七的有效成分三七总皂苷对于PD 具有一定 疗效温胆益脑汤联合多巴丝肼能在一定程度上改善PD 患
者的认知能力和日常的生活能力[|31，中医药防治PD 的机制研 究||4"16]表明，临床P D 的有效方剂大补阴丸对M PTP 诱导 的PD 小鼠行为学有明显改善作用，对黑质中多巴胺能神经元 数量、线粒体形态、线粒体酶复合物活性等均有保护作用。最近 有研究表明，中药复方大补阴丸和牵正散可通过维持线粒体动
态平衡和改善M PP+诱导的线粒体损伤来保护神经元M 。
本研究旨在构建PINK 1基因敲除的帕金森病的细胞模
型，通过脂质体将PINK 1基因敲减质粒转染人SH -SY 5Y 细胞 中，培养24 h 后，通过荧光倒置显微镜观察细胞内绿荧光蛋 白的表达情况，实验结果显示，转染了空载体和敲减质粒的细麻绳男
胞内，观测到较多的绿荧光蛋白表达，提示质粒成功转染至
细胞内，CCK -8法结果显示，转染了敲减质粒的细胞的存活率 相对正常组降低，提示细胞存在一定程度的凋亡；实时荧光定 量PCR 和W estern Blot 技术检测PINK 1基因的mRNA 和蛋 白的表达水平，正常对照组和阴性对照组细胞内PINK 1基因 的mRNA 和蛋白水平的表达均没有明显差异，而转染了
PINK 1敲减质粒的两组细胞，SH -SY 5Y 细胞内的PINK 1基因
的RNA 和蛋白的表达都降低了，提示PINKJ 基因敲减细胞模 型构建成功；另外，我们采用激光共聚焦显微镜观察，并统计分 析可知,PINKl 表达减少导致线粒体形态发生改变，从而导致 细胞死亡数量的增加。这些结果验证了以前对PINKl %21】功能 的研究，并强调了 PINK 1在维持健康细胞和线粒体功能方面 的重要作用，在突变导致PINK 1蛋白功能下降的情况下，受损 的线粒体会积聚，最终可能导致神经细胞死亡。综上所述，本研 究成功构建了 PINK 1基因shRNA 质粒载体，建立了 PFNK 1基
图6激光共聚焦观测线粒体的形态(物镜60 x ，发射波长603 n m ，激发波长559 nm)
Fig.6 A Laser Confocal observation of Mitochondrial Morphology (Objective 60 x , emission wavelength 603 nm, excitation wavelength 559 nm)A 正常组 B 空载体组 CPINKl-shRNA-39 组 D PINKl-shRNA-42 组
A: Normal group B: Empty vector group C:PINK1-shRNA-39 group D: PINK 1-shRNA-42 group
2.01」
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