荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和欧拉角海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。
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（一）两种酶的区别？
1. 底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。
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2. 发光的颜不同：卷曲霉素萤火虫荧光素酶产生的光颜呈现黄绿，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。
（二）为什么采用双荧光素酶报告系统？
单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
1. 两种荧光素酶分别位于两个载体上。
比如研究miRNA的靶基因实验时，这两种载体分别为：
（1）pMIR-REPORT载体：它用来插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA功能。该载体包含一个CMV启动子控制下的萤火虫荧光素酶报告基因。在荧光素酶基因的3'UTR区域包 侯永庭
含一个多克隆位点，用于插入预测miRNA的结合靶序列或其他核苷酸序列。若荧光素酶活性下降，说明该段插入序列受到miRNA调节，这模仿了miRNA靶序列的作用方式。
（2）pRL系列载体（以pRL-CMV为例），pRL系列载体可在哺乳动物细胞中组成型地表达海肾荧光素酶。
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又如，研究转录因子和启动子的实验时，两种载体分别为：
（1）pGL4.20载体，pGL4.20载体含Luciferase荧光素酶报告基因，无启动子，用于研究目的启动子的功能，在荧光素酶基因的上游包含一个多克隆位点，用于插入启动子序列，若Luciferase荧光素酶活性上升，说明该段启动子受到转录因子的调控。
（2）pRL系列载体。
2. 两种荧光素酶位于同一个载体上。这样偏差更小，毕竟转染一个质粒比转染两个质粒要容易，在这方面，根据检索到的资料显示，现在的这类质粒比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒。
二、双荧光素酶报告系统有哪些应用？
（一）验证microRNA同某基因mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
（二） 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。
（三） 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。
（四） 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。
（五） 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。
（六） 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。如将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。又如，在GPCR研究中，将cAMP response element（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。
三、实验步骤（以验证Gene A为miRNA的靶基因为例）
主要分为：质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。
1.需要的病毒或者质粒：
miRNA-Ctrl/miRNA-OE（miRNA的ctrl和OE可以提前包好病毒）
pMIR-REPORT（不插入任何片段，作为control）
pMIR-REPORT-WT（将Gene A的3’UTR插入pMIR-REPORT）
pMIR-REPORT-MT（将Gene A的3’UTR突变后插入pMIR-REPORT）
pMIR-REPORT-miRNApos（将miRNA的反向互补序列插入，作为阳性对照）
pRL-CMV（作为内参）
（根据实验需要也可以再设置siRNA组）
2.实验步骤（以24孔板为例）
·Day1 种细胞于24孔板
·Day2 病毒感染（根据实验加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE）
·Day3 Report质粒转染（以24孔板一个孔为例，实验时可配置成Mix逐孔加入以减少误差）:
25ul opti-MEM+300ng plasmid+10ng pRL-CMV
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