平遥地震腺相关病毒载体介导的感染效率⽐真核表达质粒的要⾼，且⽬的 大嘴泉
基因表达稳定，⽬前已经被⼴泛应⽤于体外细胞和体内动物实验 中⽬的基因的功能研究、模型建⽴和临床试验等。越来越多实验
室的课题都要⽤到AAV病毒包装，不过在实验的过程中会出现很
多问题，⽐如载体构建、质粒抽提纯化异常、病毒滴度过低甚⾄
出不了毒等等情况。今天来聊聊这⽅⾯的问题，看看病毒包装⾼
质量的交付受到哪些因素影响，怎样能做得更好。
Q1：腺相关病毒是什么？和实验室⽤的A A V载体的区别在哪⾥？
答：腺相关病毒，即Adeno-Associated Virus (AAV), 是⾃然界中存在的天然病毒，基因组上有rep基因和cap基因，因此也叫野⽣型腺相关病毒（图⼀），即wide type AAV(wtAAV)；实验室⽤的AAV载体，是在腺相关病毒的基础上经过⼈⼯改造的质粒，基因组上没有rep基因，因此也叫重组腺相关病毒，即recom
binant AAV（rAAV）。没有特别指出的时基因，
和cap基因
候，简称AAV⼀般是指已经改造过的AAV载体。
图⼀（来源：参考⽂献1）
Q2：腺相关病毒有哪些特点，A A V适合做哪些下游实验？
答：腺相关病毒是⼀种⼩型⽆包膜病毒，属于细⼩病毒科，包含⼀个单链线性DNA基因组，长度约为4.7kb，其⾐壳蛋⽩由VP1、VP2和VP3三种蛋⽩构成，在1965年从腺病毒分离株的污染物中⾸次被发现。
Q3.腺相关病毒进⼊宿主细胞之后，其基因组会整合到宿主细胞基因组中
吗？
答：野⽣型腺相关病毒wtAAV感染⼈体细胞后，由于其rep基因、ITR序列结构和宿主基因组的相互作⽤，可能倾向整合到19号染⾊体短臂上的AAVS1位点，在⼩⿏中是倾向整合到ROSA26基因位点；⽽改造过的重组型腺相关病毒rAAV，由于基因组上已经去除了rep和cap基因，因此失去了整合到宿主基因组的特性。rAAV在体内组织，特别是在肌⾁组织中，在宿主基因组染⾊体以外以附加⼦（episome）的双链DNA形式存在，持续稳定表达⽬的基因。
稳定持续表
Q4.怎样实现A A V在动物体内稳
内
达？
答：从以下⼏个⽅⾯进⾏优化以顺利实现AAV在动物体内的持续稳定表达。
1）不同的⾎清型AAV对组织有偏向性，即在靶组织⾥⾯表达更稳定（图⼆）。根据⽂献已经报道的结果和⾃⾝课题实验设计，选择合适的⾎清型AAV，通过细胞表⾯特异性受体感染细胞，提⾼转染效率；研究深⼊之后，可以对⾐壳蛋⽩进⾏合理设计、定向进化和计算机辅助设计来筛选获得突变型的⾐壳蛋⽩，在靶向组织特异性和表达⽔平持续性上进⾏不断改善。
图⼆（来源：参考⽂献4）
2）根据研究的⽬的基因和感染的靶器官组织类型，选择合适的启动⼦。⼴谱型的启动⼦有：CMV、CAG、CBG和EF1a；如果靶向中枢神经系统星形胶质细胞，可以选择GFAP和shortGFAP启动⼦；如果想在肝脏中特异表达，选择TBG、ALB或者ApoEHCR-hAAT作为启动⼦，增强组织靶向性效果更好。
3）注意使⽤合适的AAV病毒量和滴度，感染动物时AAV病毒⽤量不是越多越好，当⽤量太多，由于病毒溢出效应的影响，⽬的基因的表达量反⽽降低。
4）对靶器官进⾏局部多点注射，使得AAV载体⽬的基因就近表达，表达效果和特异性更好。
Q5.A A V病毒载体对⽬的基因的⼤⼩是否有要
求？
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答：AAV载体的总容量是4.7kb左右（图三），由于载体中固有的启动⼦序列、PolyA序列以及两个ITR序列，这三个元件的序列总和在1200bp左右，同时可能还带有荧光标记或者抗性标记序列。所以AAV载体携带⽬的基因的时候，⽬的基因的长度建议不超过3kb。
Q6.A A V在动物体内的表达量⽐体外细胞⾼的原因
是？
答：由于AAV的基因组是单链DNA，进⼊细胞后需经过由单链变成双链的过程，才能开始转录翻译。体外培养的细胞体系中如果没有辅助病毒或者辅助因⼦的情况下，这种DNA单链转变成DNA双链的过程⾮常缓慢，所以⽬的基因表达滞后；⽽AAV注射进动物体内之后，靶器官组织⾥的各种辅助因⼦相对丰富，有助于AAV在体内快速表达，表达⽔平和持续时间更加稳定。
适合做动物实
体
Q7.为什么说A A V病毒载体适
验？
答：1）AAV的感染效率⾼于慢病毒LV，⽽其免疫原性低于腺病毒ADV；
2）利⽤不同⾎清型的AAV，能特异靶向神经系统、眼睛、肌⾁和肝脏等多种不同类型的器官组织；
3）转导途径简便，浓缩好的病毒可以直接多点注射靶器官；
化学反应工程与工艺
4）可以在体内稳定持续表达6个⽉以上，满⾜多种实验验证要求。
Q8.在动物实验中，需要注射多少总量的A A V病毒载
体？
答：研究AAV介导的外源基因功能，进⾏动物体内实验，根据动物实验低剂量、中剂量和⾼剂答：
量的分组，AAV的病毒总量⽤量约为1x1011VG/Kg、1x1012VG/Kg和1x1013VG/Kg.
Q9.⽤于动物体内实验的A A V病毒，是否需要纯化与浓
缩？
答：很有必要，AAV病毒的纯化和浓缩是病毒包装中的必需步骤。细胞裂解液中含有⼤量的病毒⾐壳蛋⽩、宿主细胞碎⽚、⾎清和细胞毒素等多种成分，这些杂质如果直接被注⼊动物体内，会导致宿主强烈的免疫反应。如果病毒滴度太低，达不到感染特定靶器官组织的⽬的。因此AAV载体经过纯化和浓缩之后，有利于后续动物体内实验顺利进⾏。具体详情可点击查看：关于AAV载体空壳率，你想了解的这⾥总结好了
Q10.A A V实验的安全注意事
项？
答：虽然AAV载体⽬前已经被全世界学术界和⼯业界⼴泛使⽤，没有报道过意外，但不排除有可能存在未知的潜在风险。AAV载体的实验操作要在符合⽣物安全防护等级⼆级实验室资质（Biosafety laboratory-2, BSL-2）的实验室中进⾏，在实验室专门区域进⾏，避免产⽣⽓溶需要对所有接触过AAV病毒载体的实验器具进⾏消毒处理。装有AAV载胶。每次实验后，
每次实验后，需要对所有接触过
体的培养瓶，需标明危险品。对实验室的成员进⾏安全培训和风险提⽰。
Q11.实验的时候怎么稀释病毒，有哪些注意事
项？
答：根据实验要求，可以⽤PBS溶液、⽣理盐⽔或者完全培养基将病毒稀释到所需要的滴度。使⽤时，将病毒样本放置在冰浴上效果更好，稀释好的病毒样本尽量⼀次性⽤完。
Q12.表⽰病毒滴度的单位有哪
些？
答：重组病毒的滴度有多种单位表⽰，这些表⽰形式的不同主要是由于病毒载体本⾝的⽣物学特点不同、不同的测定⽅法以及过去使⽤约定俗成的习惯造成的。
1）TU/mL是Transduction Unit/mL的缩写，转导单位，多⽤于慢病毒载体；
2）PFU/mL是Plaque Forming Unit/mL的缩写，指噬菌斑形成单位，常⽤于腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体；
3）VG/mL是Vector Genomes/mL的缩写，是指每mL病毒液中含有的基因组拷贝总数，⼀般⽤于表⽰AAV腺相关病毒载体的滴度。
Q13.转染效率很低，怎么
办？
答：AAV转染的时候，需要保证细胞⽣长状态良好、合适的细胞密度和优化过的感染条件。此外转染试剂很关键，建议⽤Lipo3000转染试剂。
扭力Q14.做病毒包装实验时，有时候做出来的病毒滴度很低，甚⾄不出毒，稳定性很差，为什么？
答：病毒包装涉及多个操作步骤，有⼏个⽅⾯需要注意：
1）不使⽤来源不清的质粒，尽量使⽤成熟稳定的商业化载体系统；
2）细胞培养和细胞转染时，需注意细胞密度是否适中和出毒期间细胞的活⼒；
3）按操作说明进⾏转染，注意排查质粒抽提纯化的异常情况以及⽬的基因的⼤⼩、序列和蛋⽩功能等情况是否对病毒包装产⽣影响。
Q15.A A V包装好之后，需要什么样的运输和保存条
件？
答：AAV病毒包装好之后，⽤⼲冰运输寄送。使⽤时应避免反复冻融，根据实验需要适当分装于-80℃保存，可以保存⼀年左右；-20℃保存2周左右；4℃保存⼀周。
Q16.如果不想做病毒包装实验这么⿇烦，有什么解决⽅案
吗？
答：病毒包装需要有昂贵的实验设备，操作步骤繁多，需要做质粒转染、细胞裂解、上清收集、病毒颗粒纯化和滴度纯度检测等多项质控，这些环节任何⼀个出问题都需要来回很长时间摸索验证。现在
Scilia提供AAV病毒包装的⼀站式服务，您只需提供穿梭质粒或者所感兴趣的基因名字，选择做过表达还是做⼲扰表达，剩下的交给Scilia来帮您实现。Scilia将给您提
供⾼质量⾼滴度的AAV病毒，您拿到病毒后，就可以尽快开始做下游的实验了。
⼩结：
接下来将继续分享总结AAV在科学研究领域的新进展，让⼤家了解更多实验知识避开不必要的坑，更⾼效顺利完成实验。最后，对AAV病毒包装实验有兴趣的⼩伙伴们欢迎⼤家⼀块沟通探讨。Scilia有项⽬经验丰富的专门团队和业内⼤咖给⼤家答疑解惑，助⼒您的科研项⽬。
参考⽂献
1. R. Jude Samulski, Nicholas Muzyczka. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 2014, 1(1): 427-51.
cctv3同一首歌2. Toyokazu Kimura, Beatriz Ferran, Yuko Tsukahara, et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 2019, 9(1):13601.
3. Claire Domenger, Dirk Grimm. Next-generation AAV vectors-do not judge a virus (only) by its cover. Human Molecular Genetics. 2019, 28(R1):R3-R1
4.
4. Chengwen Li, R Jude Samulski . Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 2020, 21(4): 255-272.
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