引用本文
曹金玲，张 烨，张方淋，等. PARP1通过调节RNF144A抑制乳腺癌细胞凋亡［J］. 中国癌症杂志, 2019, 29 (4): 257-264.
通信作者：李大强 E-mail：***********************
galfanPARP1通过调节RNF144A抑制乳腺癌细胞凋亡
曹金玲1，张 烨1，张方淋2，李大强1，2
1.复旦大学上海医学院生物医学研究院，上海 200032；FCI
2.复旦大学肿瘤研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032
［摘要］ 背景与目的：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，但其发病机制尚不清楚。我们前期研究发现环指蛋白144A（ring finger protein 144A，RNF144A）调节多聚ADP核糖聚生化危机网络版
合酶1［poly（ADP ribose）polymerase 1，PARP1］的稳定性，进而影响乳腺癌细胞对PARP抑制剂olaparib的敏感性。该研究旨在探讨PARP1是否对RNF144A具有调节作用及其对乳腺癌细胞凋亡的影响。方法：利用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织中PARP1的表达水平，并分析PARP1表达水平与乳腺癌患者预后的关系。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测过表达或者敲低PARP1对RNF144A蛋白水平的影响。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测敲低PARP1对RNF144A转录水平的影响。利用AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染法流式细胞术检测细胞凋亡。结果：在乳腺癌组织中PARP1表达阳性率为68%，且高表达PARP1的患者预后较差。在敲低或过表达PARP1的HEK-293T和乳腺癌细胞中，RNF144A在mRNA水平无明显变化，但其蛋白水平与PARP1表达呈负相关。Olaparib诱导细胞凋亡时，过表达PARP1细胞凋亡率较低，在过表达PARP1的细胞中重新过表达RNF144A后凋亡率有一定程度的恢复。结论：PARP1在乳腺癌细胞的表达水平与乳腺癌患者的预后相关，可能在乳腺癌的发生、发展中扮演着癌基因的角。PARP1调节RNF144A的蛋白水平但不影响其mRNA水平。PARP1可能通过负向调节RNF144A抑制乳腺癌细胞凋亡。 ［关键词］ 乳腺癌；多聚ADP核糖聚合酶1；预后；环指蛋白144A；凋亡
［Abstract］ Background and purpose: Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer, but its underlying mechanism remains elusive. The previous studies have demonstrated that ring finger protein 144A (RNF144A) regulates the stablity of poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) and thus affects the sensitivity of breast cancer cells to PARP inhibitor olaparib. This study was designed to investigate whether PARP1 could regulate RNF144A and its effect on apoptosis of breast cancer cells following treatment with olaparib. Methods: Expression levels of PARP1 in breast cancer tissues were detected by immunohistochemistry, and the relationship between PARP1 expression levels and prognosis of breast cancer patients was analyzed. The effects of overexpression or knockdown of PARP1 on RNF144A protein and mRNA expression were detected by Western blot and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR), respectively. Annexin Ⅴ-PE/7-AAD double staining was used to detect apoptosis by flow cytometry. Results: The positive rate of PARP1 expression was 68% in normal breast tissues, and patients with high expression of PARP1 had poor prognosis. Modulation of PARP1 negatively regulated RNF144A at the protein but not mR
NA level. Overexpression of PARP1 enhanced anti-apoptotic effect of cells following olaparib treatment. Moreover, introduction of RNF144A in PARP1 overexpressing cells rescued the anti-apoptotic effects of PARP1 overexpression in breast cancer cells following olaparib treatment. Conclusion: The expression levels of PARP1 are associated with the prognosis of breast cancer patients, and PARP1 may play an oncogenic role in the development and progression of breast cancer. PARP1 negatively regulates RNF144A at the protein level without affecting its transcription. PARP1 inhibits apoptosis of breast cancer cells partially through regulating RNF144A.
［Key words］ Breast cancer; PARP1; Prognosis; RNF144A; Apoptosis布兰妮最新专辑
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年增加，死亡率居女性恶性肿瘤的前列［1］。多聚ADP核糖聚合酶1［poly（ADP ribose） polymerase 1，PARP1］是核酶PARP家族表达最为丰富的一种亚型［2-3］，负责细胞内90%的聚ADP核糖聚合体的形成，可以通过聚ADP核糖基化修饰各种核蛋白［3］。聚ADP核糖基化修饰在DNA损伤修复、染质重塑、基因转录以及调节上皮-间充质转化等多种细胞生物学过程中扮演着重要的角［2，4-
5］。2014年PARP抑制剂olaparib被批准用于BRCA基因突变的卵巢癌，确定了其在癌症中的临床重要性，证实了PARP1可以作为癌症的一个新靶点夯实基础［6］。尽管PARP1是PARP蛋白家族中被广泛研究的成员之一，但它的许多生物学特征仍未被发现［3］。
环指蛋白144A（ring finger protein 144A，RNF144A）是环指间环（ring-between-ring，RBR）E3泛素连接酶家族中一个成员，它的特点是具有3个重要的结构域，包括RING1结构域、IBR结构域以及RING2结构域［7-11］。迄今为止，RNF144A的生物学功能和作用机制尚不清楚。已有文献报道RNF144A是DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-DPK）的E3泛素连接酶，可促进DNA损伤诱导的细胞凋亡［12］。本实验室的前期研究发现，RNF144A是一种潜在的肿瘤抑制基因［13］，并且在乳腺癌细胞中RNF144A促进PARP1蛋白的泛素化修饰和降解，从而影响乳腺癌细胞对PARP抑制剂olaparib的敏感性［14］。但是，PARP1是否对RNF144A具有调节作用尚未见报道。
本课题将探究PARP1是否对RNF144A具有调节作用，以及这种调节作用对乳腺癌细胞凋亡的影响，为进一步探索PARP1对RNF144A调节作用的机制奠定基础，为临床上乳腺癌
提供新的理论依据和思路。
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资料和方法
1.1 临床资料
收集复旦大学附属肿瘤医院2017年1月—2017年6月经外科手术切除、病理学检查证实为Ⅰ~Ⅲ期乳腺癌患者标本142例，患者均为女性，年龄为26~77岁，平均49.22岁。所有病例的临床资料完整，术前均未进行任何放化疗（表1）。本研究获得复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会的批准，所有患者均知情同意。
1.2 细胞培养与实验试剂
人胚肾上皮细胞HEK-293T、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、MCF-7、Hs578T均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，PARP1小干扰RNA（small interference，siRNA）套装购自上海华津生物科技有限公司，实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，AnnexinⅤ-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，Neofect DNA转染试剂购自上海腾易生物科技有限公司，PARP抑制剂olaparib购自美国Selleck公司。pCDH-HA-PARP1质粒和pCDH-Flag-RNF144A质粒见文献报道［14］，pLVX-Flag-RNF144A质粒由本实验室自行构建。兔抗人RNF144A多克隆抗体购自美国Lifespan公司（货号：LS-C162648），鼠抗人PARP1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司（货号：sc-8007），小鼠抗人Vinculin单克隆抗体购自美国Sigma公司（货号：V9131），山羊抗兔IgG二抗（货号：7076V）和山羊抗小鼠IgG二抗（货号：7074V）均购自美国Cell Signaling公司。
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