miR-490-3p调控SW1990胰腺癌细胞上皮间充质转化

昆明医科大学学报2021,42⑶：10~17 Journal of Kunming Medical University DOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S2*******

CN53-1221/R

李京辉X朱明現曲海X李秋宇現吴玉娟"，杨贺英現王郁竹"，李妍平心

(1)昆明市延安医院重症医学科；2)神经内科，云南昆明650051)

［摘要］目的研究miR-490-3p在分子水平上通过HMGA2蛋白对SW1990细胞上皮间充质转化的影响。

方法通过实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测正常胰腺导管上皮细胞HPDE和人胰腺癌细胞SW1990中miR-490-3p的表达。通过转染质粒［miR-490-3p阻遏物(inhibitor)和miR-490-3p模拟物(mimic)以及各自的阴性对照质粒］调控miR-490-3p在SW1990细胞中的表达并通过RT-qPCR法验证转染效率。转染48h后，通过CCK8检测、划痕法、Transwell小室检测，流式细胞仪检测等分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等恶性生物学特征的影响。通过Western blot检测细胞中上皮间充质转化相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达水平。同时，用数据库预测miR-490-3p及其靶基因HMGA2的靶向关系，并通过双荧光素酶报告基因实验进行验证，通过Western blot检测细胞中HMGA2的蛋白表达水平。结果(1)与HPD

E正常细胞相比，SW1990癌细胞中miR-490-3p表达水平明显降低(P=0.215)；⑵miR-490-3p上调后，SW1990细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.0001)，而细胞增殖、迁移和侵袭能力显著低于对照组(P<0.0001)o miR-490-3p下调后，SW1990细胞的凋亡率显著低于对照组(P<0.0001)，而细胞增殖、迁移和侵袭能力显著高于对照组(P<0.0001);

(3)miR-490-3p上调后，SW1990细胞中的N-cadherin表达量显著高于对照组(P<0.0001)，而E-cadherin的

表达水平显著低于对照组(P<0.0001);miR-490-3p下调后，SW1990细胞中的N-cadherin表达量显著低于对照组(P<0.0001)，而E-cadherin的表达水平显著高于对照组(P<0.0001);(4)HMGA2是miR-490-3p的靶向基因。结论miR-490-3p可通过靶向HMGA2抑制SW1990胰腺癌细胞EMT，从而影响胰腺癌的的发生发展进程，揭示HMGA2和miR-490-3p可能为胰腺癌诊断和的靶点。

［关键词］胰腺癌；上皮间充质转化；miR-490-3p；HMGA2

［中图分类号］R737.31［文献标志码］A［5：章编号］2095-610X(2021)03-0010-08

miR-490-3p Suppresses EMT of SW1990

Pancreatic Cancer Cells

LI Jing-hui ZHU Ming QU Hai n,LI Qiu-yu0,WU Yu-juan0,

YANG He-ying J),WANG Yu-zhu n,LI Yan-pin g2)

(1)Dept,of C ritical Care Medicine^2)Dept,of N eurology,Yan'an Hospital of

Kunming,Kunming Yunnan650051,China)

［Abstract］Objective To elucidate the role of miR-490-3p in regulating HMGA2expression and affecting epithelial-mesenchymal transition(EMT)of SW1990cells.Methods miR-490-3p expression was measured in HPDE and SW1990cell lines by Real-time PCR.SW1990cell lines were cultured in vitro and divided into four groups,including inhibitor-Negative control(inhibitor-NC),miR-490-3p inhibitor,mimic-Negative control (mimic-NC)and miR-490—3p mimic group,and the transfection efficiency was verified by RT-qPCR.After48h of transfection,CCK8assay,wound healing assay,Transwell invasion assay andflow cytometric were used to detect the effects of malignant biological characteristics such as proliferation,migration,invasion and apoptosis of

［收稿日期］2020-12-15

［基金项目］昆明市卫生健康委员会卫生科研基金资助项目(2020-21-01-011)；昆明市延安医院院内

基金资助项目(yyky019-040)

［作者简介］李京辉(1979-)，男，河北衡水人，医学硕士，副主任医师，主要从事重症胰腺炎及营养支持、重型颅脑损伤临床及研究工作。

［通信作者］李妍平，E-mail:119021**********

第3期李京辉，等.miR-490-3p调控SW1990胰腺癌细胞上皮间充质转化11

SW1990cell linerespectively.Western blot was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin. Meanwhile,database predicted the target genes of miR-490-3p,and dual luciferase assay confirmed the targeted relationship between miR-490-3p and HMGA2,western blot was used to detect the expression of HMGA2. Results1)The expression of miR-490-3p was downregulated in SW1990cells(P=0.215).2)Overexpression of miR-490-3p significandy inhibited the proliferation(P<0.0001),migration(P<0.0001)and invasion(P< 0.0001)of SW1990cell line and prompted apoptosis(P<0.0001);In contrast,downregulation of miR-490-3p significandy promoted the proliferation(P<0.0001),migration(P<0.0001)and invasion(P<0.0001)of SW1990cell line and inhibited apoptosis(P<0.0001).3)Upregulation of miR-490-3p significantly decreased the expression of N-cadherin(P<0.0001)and increased E-cadherin(P<0.0001)expression in SW1990cell line.In contrast,d

ownregulation of miR-490-3p significantly upregulated(P<0.0001)the expression of N-cadherin, decreased E-cadherin(P<0.0001)expression.4)HMGA2was a target gene of miR-490-3p.Conclusion These findings indicate that miR-490-3p acts as a tumor suppressor during the process of EMT through targeting HMGA2, suggesting miR-490-3p is a potential new diagnostic and therapeutic target for the treatment of pancreatic cancer.

[Key words]Pancreatic cancer;EMT;miR-490-3p;HMGA2

由于胰腺癌(pancreatic cancer,PC)的5a生存率不到6%，中位生存期不超过6个月，因而被认为是最致命的恶性肿瘤之一⑴。随着科学技术的发展，大部分癌症的预后都得到了提高，但是PC的预后自20世纪60年代以来一直保持不变⑵。PC较差的预后是由于PC早期发病症状隐匿、进展迅速，大多数PC患者在明确诊断前就已经发生了远处转移0]，且引发其转移的分子机制仍然不清楚。研究表明，微小RNA(microRNA,miRNA)可以参与调控胰腺癌的发生、发展、侵袭和转移，从而调控胰腺癌的进展“占。然而，miR-490-3p 对PC细胞恶性生理学的影响及其作用机制尚不明确o上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在生物体的发育以及肿瘤细胞的转移方面发挥着很重要的作用[7国，是肿瘤细胞发生迁移和侵袭的关键因子切。Beuran等同研究发现，PC中miRNA的异常表达与EMT相关。因此本研究初步探讨miR-490-3p对胰腺癌SW1990细胞的EMT的影响并探讨其机制。

1材料与方法

1.1实验细胞及培养

人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE和人胰腺癌细胞系SW1990，均购于上海生科院细胞库。将冻存的HPDE和SW1990细胞进行37七水浴复苏，离心后弃上清液，接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的L-15培养基(购于中国赛默飞)，置于培养箱中培养(37七、5%C02)o每2~3d 进行换液，当细胞融合度达到80%时弃培养基，PBS清洗，0.25%胰酶消化，进行传代。

1.2细胞转染及分组

将对数生长期的SW1990细胞以5x105个/孔接种于6孔板中，转染前lh，将培养液更换为不含血清的0pti-MEM培养基。参照说明，分别将miR-490-3p mimic质粒、mimic NC质粒、miR-490-3p inhibitor质粒、inhibitor NC质粒转染进SW1990细胞，每组设置3重复，转染后置于培养箱(37r,5%CO2)中培养48h，收集细胞上清液待测。质粒均由锐博生物设计合成。机械工程师考试大纲

1.3RT-qPCR检测细胞中miR-490-3p的表达

采用Trizol法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，以U6作为内参基因，采用-2丛5法计算各组细胞中miR-490-3p的相对表达量。RT-qPCR扩增引物序列，见表lo

1.4细胞增殖和凋亡能力检测

转染48h后，将各组细胞以5x103孔接

Tab.l

表1RT-qPCR扩增引物序列表

Nucleotide sequences of the primers used for real-time quantitative PCR

引物名称引物序列

miR-490-3p forward miR-490-3p reverse U6forward

U6reverse 5r-CGTGGATCCTTCTTCAACCAACGGTGGTG-3z

5r-CCAGAATTCAAAGCAGGAAGAGTAAGACTTCC-3/ 5r-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3r

5,-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3,

昆明医科大学学报

第42卷

种于96孔板，每组设置4重复孔，待细胞贴壁后继续培养48 h 。每孔加入10pX 的CCK8试剂，继

续培养2.5 h 后，收集细胞，使用全自动酶标仪检

测450 nm 波长下各孔细胞的吸光度值(0D )o 药物对细胞存活率的影响按以下公式计算，实验以三次平行实验数据为最终结果：细胞存活率二(A

处理—A 空白)/(A 对照—A 空白)x100%⑼。凋亡检测试剂盒购于东仁化学，按照试剂盒说明书操

作后使用流式细胞分选仪下检测细胞凋亡情况。

1.5细胞迁移能力和侵袭能力检测

转染48 h 后，将ibidi 插件放置于24孔板中，

在插件的左右两侧各加入70 pL 的细胞悬液，过

夜待细胞贴壁后将插件拔出，用PBS 清洗一次细

胞，加入新鲜的基础培养基培养，在Oh 和24 h 在显微镜下观察并进行拍照。

将细胞进行重悬至浓度为5x104个/mL，将

200 pL 的细胞悬液接种到铺有Matrigel 基质胶的 Transwell 小室上室，下室中加入含有500咽含

有10%胎牛血清的基础培养基，培养24 h 后，

用4%PFA 固定30 min, 0.1%结晶紫溶液染2 h,

PBS 清洗后在显微镜下观察并拍照。

1.6 Western blot 检测细胞蛋白表达水平

用RIPA 裂解液裂解细胞，提取总蛋白；BCA 法进行蛋白定量；采用12%SDS-PAGE 分离蛋白，

然后将蛋白转移至PVDF 膜上，在室温下用5% 的无脂奶粉圭寸闭lh；分别加入E-cadherin (abeam ,

1 : 5000)、N-cadherin(abcam, 1 : 1000)、HMGA2

一抗(abeam, 1 : 1000), 4七孵育过夜，次日分

别加入二抗(abeam , 1 ： 5000)，均以 P -actin 为内参，室温孵育lh, ECL 发光试剂显影，E- cadherin, N-cadherin. HMGA2 蛋白相对表达水

平采用image J 软件评估。

1.7双荧光素酶报告基因实验

构建野生型HMGA2和突变型HMGA2-3'-

UTR 荧光素酶载体，分别将载体和miR-490-3p mimics\miR-NC 共转染进293T 细胞中，转染48 h

后用双荧光素酶试剂盒检测各组荧光素酶的活性。

1.8统计学处理

数据均以平均数土标准差(mean ± SD )表示，

并通过 Graph-Pad Prism 5.0软件(GraphPad Software ,

San Diego, CA)进行统计分析。各组计数数据采

用卡方检验进行比较，计量数据采用均数土标准

差(SD)表示。如果记录的数据是正态分布的，且有均匀的方差，则使用f 检验进行两组间的比较,

P<0.05为差异有统计学意义。2 结果

2.1 HPDE 和 SW1990 细胞系中 miR-490-3p

及转染后miR-490-3p 的表达

结果显示，与HPDE 相比，SW1990中miR-

490-3p 的表达水平相较HPDE 显著降低(F 二0.215), (图 1A )。为了进一步研究 miR-490-3p 对 SW1990 细胞的影响，分别将miR-490-3p mimic A miR- 490-3p inhibitor 以及各自的阴性对照质粒转染到

SW1990细胞中，获得稳转细胞系，并通过RT- qPCR 检测细胞中miR-490-3p 的表达水平，结果

显7K ，与 inhibitor NC 组相比，miR-490-3p inhibitor 组中miR-490-3p 的表达显著降低(P< 0.0001)；

与 mimic NC 组相比，miR-490-3p mimic 组中 miR-

490-3p 的表达明显升高(P<0.0001)o 证明细胞

系构建成功(图1B )O

*岀飛

VNDFndroclr

占日廿x

HPDE SW1990

图1 miR-490-3p 在SW1990细胞中表达降低

Fig. 1 The expression of miR-490-3p significantly decreased in SW1990

A ： miR-490-3p mRNA 在不同细胞系中的表达；

B ： miR-490-3p 转染水平验证。字<0.05; **P<0.01; ***P< 0.001

第3期李京辉，等.miR-490-3p 调控SW1990胰腺癌细胞上皮间充质转化

2.2 miR-490-3p 对SW1990细胞增殖和凋亡

的影响

Annexin V/PI 双染后用流式检测细胞的凋亡

程度，结果显示，与inhibitor NG 组相比,miR-

490-3p inhibitor 组的凋亡率显著降低(P< 0.0001);

与 mimic NC 组相比，miR-490-3p mimic 组的凋

亡率显著升高(P< 0.0001)(图2A-B )。CCK8实

验结果显示，与阴性对照组对比，转染miR-490-

3p inhibitor 后细胞活力显著升高(P< 0.0001)，转

染 miR-490-3p mimic ( P < 0.0001)，后细胞活力明显降低(图2C )。

miR-490-3p mimic Gate: R]QI: 3.10

•■-■i

% T%掙匚

■

Q4:12.79%

mimic NC

Gate: R1

QI: 0.09力 Q2:5.02%

.2黨;

Q3:B

>% Q4:2.89%

miR-490-3p inhibitor

Gate: R1QI ： 1.27%

Q2:0.15%

Q3：辔5% Q4:1.62%

A inhibitor NC

Gate: R1

QI: 0.01

% Q2:0.82%

他 Q4: 7.32%

1 000

1000制氢

1000

100

100100

100100 1 000

FL1-FITC

SW1990

候顺利C

SW1990

110 100 1 000FL1-FITC 10 100 1 000FL1-FITC

10 100 1 000FL1-FITC 25

10050

軒S 富尿

5 O

1 1o

图2 miR-490-3p 促进SW1990细胞凋亡

Fig. 2 miR-490-3p promoted SW1990 cell apoptosis

A ：细胞凋亡实验；

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B ：细胞凋亡率；C：细胞活力。***P<0.001;

0.000lo

2.3 miR-490-3p 对SW1990细胞迁移和侵袭

的影响

与阴性对照组相比，miR-490-3p inhibitor 组

SW1990细胞迁移率(P < 0.0001)和细胞侵袭数量

(P< 0.0001)显著升高,miR-490-3p mimic 组的细

胞迁移率(P < 0.0001)和细胞侵袭数量(P < 0.0001) 显著降低(图3A-D )。

2.4 miR-490-3p 对 SW1990 细胞 EMT 的影响

通过 Western blot 检测 EMT 标志物 E-cadherin 和N-cadherin 在SW1990细胞内的表达，结果显操作条件反射

示，在 miR-490-3p inhibitor 组中，E-cadherin 的表达显著降低(P V 0.0001), N-cadherin 的表达显

著升高(P V 0.0001)；在 miR -490-3p mimic 组中， E-cadherin 表达显著升高(P< 0.0001), N-cadherin

表达显著降低(P< 0.0001)(图4A-C)。结果表明，

miR-490-3p 对SW1990细胞中的EMT 具有抑制作用。

2.5 HMGA2是miR-490-3p 的靶向因子

为了探究miR-490-3p 表达下调对SW1990 胰腺癌细胞功能影响的机制，本文通过ENCORI 数据库筛查在胰腺癌患者和正常人之间的差异表达的基因，筛选出的差异基因中HMGA2的高表

达与胰腺癌患者的不良预后有关(图5A )，并且在

胰腺癌患者内HMGA2与miR-490-3p 的表达呈负相关(图5B )，这说明了 HMGA2与miR_490-3p

可能具有靶向关系，共同调控胰腺癌的进展。本

文通过 TargetScan 、miRDA 和 microRNA 三个数据库对miR-490-3p 与HMGA2S 的靶向关系进行

预测，结果显示，HMGA2可能是miR-490_3p 的

靶点(图5C )。

进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证

HMGA2和miR-490-3p 靶向结合关系。结果显示

昆明医科大学学报

第42卷

24 h

inhibitor NC

miR-490-3p inhibitor

mimic NC

miR-490-3p mimic

厂 [L |

D 200 r SW1990

图3 miR-490-3p 抑制SW1990细胞迁移和侵袭

Fig. 3 miR-490-3p inhibited the invasion and migration of SW1990 cell

A ：细胞划痕实验；

B ：细胞侵袭实验；

C ：细胞迁移率；

D ：侵袭细胞数。槿*Pv 0.000 1。

A B

E-cadherin

N-cadherin

130 kDa

名与实

严actin

01000 ・* 位 kDa

.O .5O

埶 m tio x

w 启 J u q p

E O

I ffl

u -c

(D q p E o I N

图 4 miR-490-3p 抑制 SW1990 细胞的 EMT Fig. 4 miR-490-3p inhibited the EMT of SW1990 cell

A ： E-cadherin 和N-cadherin 蛋白的表达；

B ： E-cadherin 蛋白表达水平分析；

C ： N-cadherin 蛋白表达水平分析。***P<0.001;ra P< 0.000 l o

共转染 miR-490-3p mimic 及野生型 HMGA2-3' UTR 质粒能显著降低相对荧光素酶活性(P< 0.001), 而共转染miR-490-3p mimic 及突变型HMGA2-

3' UTR 质粒时，相对荧光素酶活性没有显著变

化(图5D )。以上结果表明miR-490-3p 与HMGA2

可以靶向结合。同时，SW1990细胞中的HMGA2 的蛋白表达水平也通过Western blot 进行检测。

结果显示，与inhibitor NC 组相比，HMGA2在miR-

490-3p inhibitor 组中表达升高(P= 0.0089)，在 miR-490-3p mimic 的刺激下，HMGA2

在细胞中

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