张晓一一、腺病毒载体的特点有哪些
腺病毒载体时基因最常用的病毒载体。腺病毒载体的特点：a、作为真核系统基因调控模型，腺病毒的基因组结构和功能已经有较为广泛和深入的研究，为研制基因载体提供了坚实的基础；b、包装容量较大，宿主范围广泛，感染效率高，对非增生分裂细胞也有感染；c、理化性质稳定，制备方便易纯化和浓缩d、遗传毒性较低，因为腺病毒的感染和复制过程无需整合入宿主的基因组，由腺病毒转载的外源基因以附加方式表达；e作为活疫苗，不会产生明显的副作用，比较安全。F 、Ad2和Ad5对人和动物无致瘤作用。 二、细胞内同源重组制备腺病毒载体
原理：较小的穿梭载体和293细胞内的Ad基因质粒之间通过同源重组，获得重组腺病毒载体。其中Ad基因质粒即pJM17，是将pBR322插入到环化的野生型Ad基因组的E1区的XbaI位点得到。该质粒由于pBR322质粒的插入而变得太大，无法进行腺病毒的包装。穿梭质粒pAd13含有Ad的左端臂，其中E1区已被转基因的表达盒所替换。当两个质粒共转染含有E1区的293细胞后，在细胞体内就可以同源重组，从而制备重组腺病毒载体。载体家 实验操作高庆狮
1、穿梭载体的构建
a把目的基因插入到pAd13载体质粒中就形成所需要的携带有目的基因表达框的穿梭载体质粒。
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2、重组腺病毒的制备
A、293细胞的准备。在转染前一天接种7×105个293A细胞在60mm平皿，37度培养。转染前3-4小时更换新鲜培养基。型采
B、脂质体转染细胞。将6ug穿梭质粒和2ug pJM17共转染准备好的细胞。
C、转染48h后，将细胞分至3个培养皿继续培养，隔天补加培养基，7天后可见细胞病变。
3、收集病变细胞和上清，-70度冻融3次，离心收取上清。
4、扩增病毒。用病变上清液感染新的293A细胞，感染48h后收取呈CPE的细胞和上清。
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