第42卷第1期2021年1月
Vol.42No.1
January2021中山大学学报（医学科学版）
JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）
构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR在肿瘤细胞中 的相互作用分子
巫孟师，熊敏敏，彭丹，韩雪，钟小敏
（中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心，广东广州510080）
摘要：【目的】为了探讨lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的作用机制，本研究拟构建一种新的MS2-RIP方法用于鉴定DANCR的相互作用分子。【方法】利用MS2噬菌体衣壳蛋白可与噬菌体复制酶编码基因5’端一段由19个碱基组成的RNA茎环结构序列，即MS2结合位点（MS2Binding Site，MS2BS）高效结合的特点，构建串联表达MS2BS 和DANCR的过量表达质粒，通过MS2蛋白与MS2BS的亲和作用，使DANC R得到富集，并且同步捕获与DANCR相互作用的分子，用于进一步分析鉴定。【结果】成功构建串联表达MS2BS和DANCR的过量表达质粒用于MS2-RIP 实验，该实验可显著富集DANCR以及作为阳性对照的DANCR结合蛋白EZH2。【结论】基于MS2蛋白与MS2结合位点的高效结合特性，我们针对lncRNA DANCR建立了MS2-RIP方法。该方法可有效富集DANCR以及与DANCR 结合的生物活性分子，为研究DANCR的作用机制提供一种新的技术手段。
关键词：MS2；RNA结合蛋白免疫沉淀；长链非编码RNA；DANCR
中图分类号：R31文献标志码：A文章编号：1672-3554（2021）01-0024-09
MS2-RIP Assay for Identifying the Interaction Partners of lncRNA DANCR in Tumor Cells WU Meng-shi，XIONG Min-min，PENG Dan，HAN Xue，ZHONG Xiao-min （Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering，Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-Sen University，Guangzhou
510080，China）
Correspondence to：ZHONG Xiao-min；E-mail：*******************.edu
Abstract：【Objective】To explore the functional mechanism of lncRNA DANCR in tumor cells，a MS2-RIP method was designed and conducted to identify the molecules that interact with DANCR.高纯度的氧化铜
【Methods】The specific binding of MS2bacteriophage capsid protein and MS2binding site（MS2BS），a19-base RNA stem-loop structure located at the5' terminus of the MS2bacteriophage replicase gene，was applied to construct a plasmid for tandemly overexpressing DANCR and MS2BS.DANCR was enriched and its associated molecules were further identified and analyzed.【Results】The plasmid for tandemly overexpressing DANCR and MS2BS was successfully constructed for the MS2-RIP experiment，which could significantly enrich DANCR and DANCR-binding protein EZH2as a positive control.【Conclusion】Based on the high affinity binding between MS2protein and MS2BS，the MS2-RIP method was established for lncRNA DANCR，which could effectively capture DANCR as well as its associated molecules，providing a new technology for studying the functional mechanism of DANCR.
Key words：MS2；RNA-binding protein immunoprecipitation（RIP）；long non-coding RNA（lncRNA）；DANCR
［J SUN Yat⁃sen Univ（Med Sci），2021，42（1）：24-32］·基础研究·
收稿日期：2020-10-13
基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFA0105501）；广东省科技计划项目（2015A020212019）
作者简介：巫孟师，在读硕士研究生，研究方向：干细胞与再生医学，E-mail：******************；钟小敏，通信作者，副教授，博士生导师，E-mail：*******************.edu
第1期巫孟师，等.构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的相互作用分子
DANCR（differentiation antagonizing non-protein coding RNA）是一个最初在人表皮祖细胞中被发现具有维持细胞未分化状态功能的长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA）分子［1］。近年来的研究显示，DANCR在多种肿瘤中存在异常高表达的现象，提示其在肿瘤的发生和发展中具有重要作用［2-7］。虽然DANCR在肿瘤发生发展中的重要功能逐渐被揭示，但是对于DANCR作为癌基因（oncogene）的作用机制尚未完全探讨清楚。研究结果表明，lncRNA发挥功能的主要方式之一是直接结合具有调控功能的蛋白质或核酸分子［8-11］。为了阐明DANCR在肿瘤细胞中的作用机理，本研究致力于构建一种基于MS2RNA结合蛋白的特性，用于鉴定与DANCR相互作用的生物活性分子的新方法。MS2RNA结合蛋白实质为RNA 型噬菌体MS2外表面的衣壳蛋白，通过特异性结合噬菌体复制酶编码基因5’端由19个核苷酸组成的RNA茎环结构，即MS2结合位点（MS2Bind⁃ing Site，MS2BS），起着保护噬菌体核酸以及抑制翻译的作用［12］。本研究计划构建表达Flag-MS2-EGFP融合蛋白以及串联表达DANCR-MS2BS的两种载体，使用Flag抗体对MS2RNA结合蛋白进行免疫沉淀，同时对DANCR-MS2BS进行富集，并进一步使用已被证明为DANCR相互作用分子的EZH2蛋白作
为阳性对照［11］，验证MS2-RIP方法的效果。成功构建MS2-RIP方法，对于探讨DANCR的工作机理具有重要的推动作用，也可以为鉴定其他lncRNA的相互作用分子提供技术基础。
1材料与方法
1.1细胞株、菌株及质粒
人结肠癌HCT116细胞（购自中国科学院细胞库）及大肠杆菌菌株DH5α（购于天根生化科技有限公司）。pPyCAGIP（由Prof.Austin Smith from University of Cambridge赠予），pSL-MS2-12X和pMS2-GFP质粒（购于Addgene公司）。
1.2试剂
DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒（购于天根生化科技有限公司）；限制性核酸内切酶BglⅡ、SacⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ（购于New England BioLabs公司）；Infusion kit（购自Takara公司）；Mil⁃lipore RIP试剂盒（购自Millipore公司）；RNA提取试剂TRI-Reagent（购自MRC公司）；逆转录试剂盒（购自近岸蛋白质科技有限公司）；TGXStain-Free 丙烯酰胺免染制胶试剂盒（购自Bio-Rad公司）；荧光定量PCR试剂（购于Roche公司）；EZH2抗体试剂（购自Cell Signaling Technology公司）；ViaFect 转染试剂（购于Promega公司）；ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads试剂盒（购自Sigm
a公司）；RNA pulldown试剂盒（购自ThermoFisher公司）；IP Lysis buffer（购自ThermoFisher公司）。本文所用引物及探针由生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1，探针序列见表2。
1.3细胞培养
HCT116细胞使用DMEM高糖培养基（Gibco，美国），添加100mL/L胎牛血清（PAN，德国）及双抗（100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；Hyclone，美国），置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。
1.4Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP质粒构建
以pMS2-GFP质粒为模板，用MS2-GFP-F和MS2-GFP-R引物扩增MS2-GFP开放阅读框。扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。然后用限制性内切酶BglⅡ和SacⅠ酶切载体Flag/pPyCAGIP，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。将回收的MS2-GFP片段和线性载体用Infusion酶连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α中，使用氨苄抗性的LB平板筛选阳性克隆。挑取单克隆摇菌扩增，提质粒，送生工生物测序。测序正确的菌液转移至30mL含氨苄抗性的液体LB培养基中摇菌过夜，取0.5mL菌液与0.5mL已灭菌的30％甘油混合保存于-80℃，剩余菌液使用质粒小提试剂盒进行质粒提取。
1.5DANCR-MS2BS(12X)/pPyCAGIP质粒构建
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以pSL-MS2-12X质粒为模板，用MS2（12X）-F 和MS2（12X）-DANCR-R引物扩增MS2BS（12X）片段。扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。以HCT116细胞提取的RNA进行逆转录后的cDNA为模板，用MS2（12X）-
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DANCR-F和DANCR-R1引物扩增DANCR片段，扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。然后用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切载体pPyCAGIP，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收电泳产物。将回收的MS2BS（12X）片段、DANCR片段和线性载体用Infusion酶连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α中，使用氨苄抗性的LB平板筛选阳性克隆。挑取单克隆摇菌扩增，提质粒，送生工生物测序。测序正确的菌液转移至30mL含氨苄抗性的液体LB培养基中摇菌过夜，取0.5mL菌液与0.5mL已灭菌的30％甘油混合保存于-80℃，剩余菌液使用质粒小提试剂盒进行质粒提取。
1.6质粒转染与RNA结合蛋白免疫沉淀
接种50％密度的HCT116细胞于100mm细胞培养皿，于含体积分数5％CO2的37℃培养箱培养24h后进行转染。转染试剂（μL）与转染质粒（μg）
的比例是3∶1，用1mL Opti-MEM稀释质粒。质粒用量和组合分别为12μg Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和8μg DANCR-MS2BS（12×）/pPyCAGIP、12μg
Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和8μg DANCR/pPyC⁃AGIP、12μg pPyCAGIP和8μg DANCR-MS2BS （12×）/pPyCAGIP。室温放置5min，分别加入60μL ViaFect转染试剂，轻轻混匀室温放置15min。将细胞培养皿中的完全培养基换成无血清的DMEM 高糖培养基，然后将混合液加入到细胞培养皿中。24h后更换为新鲜完全培养基，转染48h后用2.5g/L 胰酶消化后，用细胞计数仪确定细胞数量。取1×107个细胞至1.5mL干净EP管中，用预冷的PBS洗两遍后加入50μL lysis buffer裂解细胞，放置于-80℃过夜。将细胞裂解液从-80℃取出于冰上解冻，每个样品各取出5μL input（RNA）和5μL input （蛋白），然后分别加入430μL wash buffer，17.5μL 0.5mol/L EDTA，2.5μL RNase Inhibitor，吹打混匀，于4℃10000×g离心10min。取30μL ANTI-FLAG M2Magnetic Beads悬液，用RIP kit里的wash buffer 洗两遍。取离心后的上清于准备好的磁珠中，4℃孵育过夜。用wash buffer洗磁珠5次，然后将磁珠分成两份，分别用于RNA和蛋白质提取。
牙科手机维修1.7RNA pulldown
使用Primer3网站设计探针序列，并由生工生物合成5’端带生物素标记的探针。取1pmol探针和50μL Pierce Nucleic-Acid Compatible Streptavi⁃din Magnetic Beads常温结合30min。取1×107个HCT116细胞至1.5mL干净EP管中，加入120μL IP Lysis Buffer裂解细胞，冰上放置5min后，加入20μL Protein-RNA Binding Buffer（10×）、60μL 50％甘油，吹打混匀，于4℃10000×g离心10min。
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第1期巫孟师，等.构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的相互作用分子
分别取20μL上清作为RNA input和总蛋白input，将剩下的上清加入结合探针的磁珠中，4℃孵育过夜。用1×wash buffer洗磁珠2次，然后将磁珠分成两份，分别用于RNA和蛋白质提取。
1.8实时荧光定量PCR分析
加入500μL Trizol到用于RNA提取的磁珠中，颠倒混匀，室温放置15min，加入200μL DEPC 水，颠倒混匀后室温放置15min，4℃，12000×g离心15min，取600μL上清至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇和5μg糖原后充分混匀，室温放置10min，4℃，10000×g离心15min，管底可见白沉淀。弃上清，每管加入400μL750mL/L 乙醇漂洗，4min，5000×g，弃上清后，重复一遍漂洗过程，晾干RNA沉淀至边缘透明时加入适量DEPC水溶解，提取的RNA全部按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。设计实时荧光定量PCR 引物，q-DANCR-F：GCCACTATGTAGCGGGTTTC；q-DANCR-R：GCCTGTAGTTGTCAACCTGC；q-U1-F：TTTCCCAGGGCGAGGCTTAT；q-U1-R：TGCAG⁃TCGAGTTTCCCACATT，荧光定量PCR每孔体系为：cDNA1μL、SYBR5μL、引物2μL、水2μL，总体系10μL，荧光定量PCR仪检测，数据分析。1.9蛋白免疫印迹
加入适量的1×loading buffer到用于蛋白提取的磁珠中，95℃处理10min，于磁力架上取含蛋白的上清至新的EP管中备用。Western blot10%预混胶配制，①分离胶：3mL Resolver A，3mL Re⁃solver B，30μL10%APS（Ammonium persulfate，过硫酸铵），3μL TEMED。②浓缩胶：1mL Stacker A，1mL Stacker B，10μL10%APS（Ammonium persulfate，过硫酸铵），2μL TEMED。取准备好的样品进行垂直电泳，200V，30min。电泳结束后，将分离的蛋白质转膜到0.45μm聚偏二氟乙烯（PVDF）上，200mA60min。转膜结束后，取出PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1h。用5%BSA配制EZH2一抗，4℃孵育过夜。取出室温摇床上再继续孵育30min后，用TBS/T洗3次，5min/次；加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h。用TBS/T洗3次，5min/次，加入化学发光底物ECL，使用Bio-Rad成像系统检测条带。
1.10统计学分析
统计分析采用SPSS26.0完成。两组计量资料的比较采用独立样本t检验，多组计量资料的比较进行单因素方差分析，方差分析有统计学意义时多重比较采用LSD、Dunnett's t检验，检验水准α=0.05。
2结果
2.1构建重组载体Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和DANCR-MS2BS(12×)/pPyCAGIP
本研究构建了两个重组载体Flag-MS2-EGFP/ pPyCAGIP和DANCR-MS2BS（12×）/pPyCAGIP，用于下游MS2-RIP实验。Flag-MS2-EGFP/pPyCA⁃GIP载体用于外源过量表达带有Flag标签和GFP 荧光蛋白的MS2RNA结合蛋白。Flag标签由于其氨基酸序列较短，一般不会干扰融合蛋白（本研究中为MS2蛋白）的天然构象。另外，耦联高特异性Flag抗体的磁珠，较容易从商品化渠道购买获得，可保证不同批次的RIP实验结果的稳定性。因此，我们在构建重组载体时，引入Flag标签至MS2蛋白的N端，用于高效捕获MS2蛋白。另外，MS2蛋白的C端还带有融合表达的EGFP蛋白，便于直接观察融合蛋白Flag-MS2-EGFP的表达效率。DANCR-MS2BS（12×）/pPyCAGIP载体用于过量表达5’端带有MS2BS（12个拷贝）的重组型DANCR转录本。带有MS2BS的DANCR，可有效地被MS2蛋白识别及捕获，并且不受DANCR本身序列性质的影响。该策略的另一个优势是，MS2蛋白的作用位点独立于DANCR转录本，因此不会干扰其他与DANCR相互作用的分子的结合。另外，我们还构建了不带有MS2BS的DANCR重组载体DANCR/pPyCAGIP作为对照，用于评估系统性的非特异结合背景。以上质粒的构造见示意图1。
2.2检测重组载体的表达效率
将下列三组质粒分别转染HCT116细胞：（Test group）Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和DANCR-MS2 BS（12×）/pPyCAGIP；（Control group1）Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和DANCR/pPyCAGIP；（Control group 2）pPyCAGIP和DANCR-MS2BS（12×）/pPyCAGIP。转染后48h，检测细胞荧光强
度和DANCR的表达水平。转染后的HCT116细胞荧光和明场合成图如图所示（图2A），Test group和Control group1的荧光强度相近，绿荧光蛋白成功表达。随后，提取HCT116细胞的总RNA检测DANCR的过表达水平。结果如图2B所示，Test group，Control group1
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第42卷
中山大学学报（医学科学版）和Control group 2中，DANCR 的表达水平分别为WT HCT116细胞的（427.35±10.13）倍，（348.60±6.14）倍，以及（523.37±3.76）倍。（4组样本量分别为
3，做单因素方差分析F =4019.50，P <0.001；Dun⁃nett's t 检验中，Test group 与WT 相比较，P <0.001；
Control group 1与WT 相比较，P <0.001；Control group 2与WT 相比较，P <0.001）2.3
MS2-RIP 方法的富集效果
如上所述，将Test group ，Control group 1和Con⁃
trol group 2三组质粒分别转染HCT116细胞。48h 后收集1×107细胞进行MS2-RIP 实验（图3）。从MS2-RIP 获得的免疫沉淀复合物提取RNA ，用于检测DANCR 的富集效果，并以U1作为参照。荧光定量PCR 结果如图4A 所示，与Control group 1、2
景德镇高专学报
比较，Test group 中DANCR 有明显的富集效果。Test group 富集的DANCR 占相应input 的比例为
（0.0835±0.0048）%，而两个Control group 分别为（0.0077±0.0072）%及（0.0043±0.0034）%，Test group 与两组Control group 的差异都具有统计意义（3组样本量分别为3，单因素方差分析结果显示，F =203.665，3组DANCR 的富集水平有差异；LSD 检验结果表明，Test group 与Control group 1相比较，P <0.001；Test group 与Control group 2相比较，P <0.001；Control group 1与Control group 2相比较，P =0.475；图4A ，左）。然而，Test group 对非编码RNA U1的富集量为（0.0819±0.0218）%，与两个Control group 的富集量（0.0875±0.0106）%和（0.0600±0.0029）%相比，差异没有统计意义（3组A B
A ：Green fluorescence of HCT116post-transfection with the indicated plasmid combinations.
B ：The expression level of DANCR in transfected
HCT116cells.
如何增强班级凝聚力
图2
重组质粒表达效率检测
Fig.2
Expression efficiency of recombinant vectors
A
B
A ：Diagram of Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP,DANCR-MS2BS (12×)/pPyCAGIP and DANCR/pPyCAGIP.
B ：Plasmid combinations of Test
group,Control group 1and Control group 2.
图1质粒构建及实验分组示意图
Fig.1Diagram of plasmid construction and plasmid combinations of groups
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