秦超
复苏293T细胞,传2-3代进行转染,转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。 转染步骤:(以10cm培养皿为例)
最好在铺细胞后20h左右进行转染,控制转染前细胞密度70%—90%,保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基(约5ml)换成新的(含血清,因为此转染试剂不需换液)。GROKSTER
加psin 10ug,pspax2 10ug,pmd2。g 5ug于800ul opti—mem,混匀
加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem,混匀,室温静置5min
将所得的转染试剂稀释液滴加到所得到的质粒稀释液中,边加边轻轻混匀,室温放置20min
取出细胞培养皿,将得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中,前后轻轻推摇使混合均匀,放回培养箱。
2.收毒(36—48h)
收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率,一般达到60%即可。
将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中,然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可)中。4000rpm离心至所需体积.
浓缩完毕后,吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装,-80℃冻存。由于反复黑龙江省国土资源厅冻西藏教育融会降低慢病毒滴度,因此避免反复冻融.
3.接毒
接毒前12-20h铺细胞迷失东京影评>igs,使接毒时细胞密度约为40%—50%,务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中,加polybrene使其终浓度为8ug/ml
细胞密度60%—70%时可以再接毒一次.
4.检测及培养细胞系(48h)
如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率,如需用药杀用puromycin杀三天(对照组完全杀死),剩下的即为基因整合进去我是凡客的细胞。如需培养成细胞系,可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清,待细胞聚团时用胰酶消化一下,使细胞铺匀。