基因转染IgH V1-G M-C SF基因在树突细胞中的表达 李绵洋朱平王红霞蔡鹏达万明
=摘要>目的探讨基因颗粒轰击转染人树突细胞(DC)的方法，以及基因转染基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA310在DC中的表达。方法利用Ficoll密度梯度法分离人外周血单个核细胞(PBM C)，贴壁方法获取单核细胞作为DC前体，在重组GM-CSF和IL-4的支持下诱导培养为用于转染的未成熟DC(imDC)；制备人免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因疫苗质粒和增强绿荧光蛋白质粒(pEGFP)。设定不同的转染条件，采用基因方法将pEGFP质粒转染入DC，荧光显微镜下分别计数绿荧光阳性细胞数和细胞总数，计算转染率；台盼蓝染计数活细胞，计算细胞存活率；比较基因、脂质体及电转染3种方法的转染效率。以基因方法在最佳条件下将IgHV1-GM-CSF/pcDNA310及pEGFP质粒共转染DC，提取细胞RN A,RT-PCR方法检测Ig HV1-GM-CSF的表达,ELISA方法检测GM-CSF的表达。结果选择基因转染的优化条件为：转染压力120psi、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度0102mg/ml、微载体负载量(ML Q)015mg金/子弹、DN A负载率(DLR)115L g质粒DNA/子弹。基因转染的效率为1015%?214%(n=3)，电转染方法为4512%?516%(n=3)，而脂质体方法只有个别DC表达荧光蛋白，三者比较差异有统计学意义(P<0101)。基因方法转染的DC能够保持其特殊细胞形态，细胞表面标志在转染中无明显变化，而电转染后细胞大量死亡。应用基因转染方法，基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA310在DC中得到瞬时表达。结论基因颗粒轰击可使基因疫苗在DC中成功表达，是临 床细胞免疫中DC转染的一种可行选择。
=关键词>生物弹道技术；树突细胞；转染
=中国图书资料分类号>Q78=文献标识码>A=文章编号>0577-7402(2009)09-1066-04
Expression of par ticle gun-transfected IgHV1-GM-C SF gene in den dritic cells
LI Mian-yang,ZHU Ping*,W ANG Hong-xia,CAI Peng,DA Wan-ming1Department of Clinical Laboratory, General Hospital of PLA,Beijing100853,China
*Corresponding author,E-mail:zhuping1@yahoo1com1cn
=A bstract>Objectiv e To ex plore the application of parti cle-gun technique i n transfecting dendritic cells(DCs),and investigate the expression of DN A vaccine particle IgH V1-GM-CSF in DCs induced by particle-gun.M ethods Monocytes were isolated from donor per ipheral blood collected by Ficoll density gradient method and adherent culture,and then differentiated into immature DCs(imDCs)by rhGM-CSF and rhlL-4induction.T he plasmids fo r transfection were IgHV1-GM-CSF/pcDNA310and pEGFP,which were prepared with endofree plasmid purification kit.T he DCs were transfected with plasmi d pEGFP by particle-gun at different transfection conditions,the green fluorescence positive c
ell and the total cell numbers wer e counted respectively under fluorescence microscope,and the tr ansfection efficiency was calculated;the viable cell count was performed after trypan blue staining;the transfection efficiencies of particle-gun, liposome-mediated transfection and electroporation method were compared.The plasmids IgHV1-GM-CSF/pcDNA310and pEGFP were cotransfected into imDCs by particle-gun under the o ptimum conditions,and then DN A was extracted,the expression of IgH V1-GM-CSF was determined by RT-PCR,and of GM-CSF by ELISA.Results T he optimum conditions of particle-gun transfection in imDCs were: gas pressure at120psi,PVP concentration in0102mg/ml,microcarrier loading in015mg gold/shot,and DNA loading rati o in115L g plasmid/mg gold.T he transfection effi ciencies of particle-gun and electroporation were1015%?214%(n=3)and4512%?516%(n=3) respectively,while that of liposome-mediated transfection was very low,and significant difference existed among the three methods(P< 0101).Furthermore,imDCs transfected with particle-gun could retain the special morphology,and its surface markers had no markedly change,while most of the cells died after transfection by electroporation method.Transient expression of gene vaccine IgHV1-GM-CSF/ pcDNA310in imDCs was observed after particle-gun transfection.C o nclusion Particle bombardment of particle-gun can induce the expression of gene vaccine Ig HV1-GM-CSF in imDCs,which provides a suitable techni cal selection for cellular immunotherapy.
=Key words>biolistics;dendritic cells;transfection
近年来，树突细胞(dendritic cell,DC)已成为慢性
病毒感染和肿瘤免疫生物领域关注的热点[1]，策略主要包括采用各种方法向肿瘤细胞直接输注DC负载病原或肿瘤相关抗原，体外扩增功能特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等。有研究表明，采用基因转染的方法，将肿瘤细胞DNA和RNA导入DC，比负载抗原肽的DC能够发挥更强的免疫作用[2]。原代细胞诱导培养DC的过程中细胞基本不分裂，对其进=作者简介> 李绵洋，医学博士，主治医师。主要从事血液病实验室诊断及免疫研究
=作者单位> 100853北京解放军总医院临床检验科(李绵洋、王红霞)，血液科(达万明)；北京大学第一医院血液科(朱平)；北京道培医院特检中心(蔡鹏)
=通讯作者> 朱平,E-mail:zhuping1@yahoo1com1cn
=基金项目> 科技部国际科技合作重大项目(2006DFB31430)；国家高技术研究发展计划资助项目(2008AA062503)
行基因修饰从方法学上来说比较困难，本实验对基因颗粒轰击转染DC及转染后基因疫苗质粒在DC中的表达进行探讨。
digital chaos
1材料与方法
111制备转染级高纯质粒IgHV1-GM-CSF/pcD-NA310质粒由北京大学第一医院朱平教授构建(国家专利号ZL20041007049815)，增强绿荧光蛋白质粒(pEGFP)由北京大学第一医院卜定方老师赠送。采用无内毒素质粒纯化试剂盒(Qiagen公司)提取制备高纯质粒，具体操作按试剂盒说明进行。
112携带质粒DNA的基因微载体子弹制备采用Helios基因系统(Bio-Rad公司)配套的子弹制备工作站、子弹切割器进行制备。将亚精胺水溶液与金颗粒混合，超声混匀，加入质粒pEGFP，采用Vortex震荡混匀，同时滴加CaCl2溶液，用无水乙醇洗涤沉淀4次, 3ml聚丙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)乙醇溶液重悬DNA/金微粒；立即将悬液均匀吸入子弹制备工作站的包被管中，静置2~5min，轻轻吸出上清，旋转180b,3~4s后打开工作站，转动开关，使DNA/金微粒涂布于管壁,20~30s后打开氮气进行干燥；用子弹切割器切割，放入含干燥剂的容器中，密封后置干燥环境中保存备用。
113DC的诱导培养正常人外周血单个核细胞(PB-MC)单采物用RPMI1640无血清培养基稀释1倍，加入预先装有等量Ficoll(GE Heathare公司)的试管中，离心后获得PBMC，以AIM-V无血清培养基(Invitro-gen公司)调整细胞浓度为510@106/ml后进行培养，弃去悬浮的淋巴细胞，以贴壁的单核细胞作为DC前体，加入GM-CSF、IL-4(终浓度均为1000U/ml)后在37e、5%CO2、饱和湿度下诱导培养，第3天可再次加入GM-CSF、IL-4(终浓度均为1000U/ml)，第5天即可获得具备特殊形态的未成熟DC(imDC)。
114基因颗粒轰击方法转染DC及转染条件的优化基因消毒，装载质粒DNA子弹，连接氦气系统；收集培养的DC，用AIM-V无血清培养基调整细胞浓度为5@107/ml，将20L l细胞悬液加入到35mm直径的平皿中间，铺开约115cm液面；基因垂直对准平皿中的细胞，触发射击；加入2ml AIM-V无血清培养基，轻轻摇匀，继续培养，荧光显微镜下观察蛋白的表达。
进一步对影响转染效果的主要因素进行优化，包括氦气压力、PVP浓度、微载体负载量(MLQ，即每个微载体子弹上结合的金颗粒量)、DNA负载率(DLR，即每毫克金颗粒包被的DNA量)。分别改变其中一项参数进行转染，测定转染率。
转染率、细胞存活率的计算：转染后24h，细胞涂片后在荧光显微镜下计数表达荧光的细胞占所有细胞的百分比，即为转染率；用台盼蓝染后计数不着细胞占所有细胞的百分比，即为细胞存活率。
115与其他方法转染DC效果的比较分别用脂质体及电转染等方法转染DC，测定各自的转染效率，并与基因转染进行比较。电转染采用直接转核的方法，按试剂盒(Human Dendritic Cell Nucleofector Kit, Amaxa公司)设定的程序进行；脂质体方法用Lipo-fectamine TM2000(Invitrogene公司)进行，按照试剂推荐的最佳脂质体/DNA比例进行。
116转染前后DC表型的测定于基因转染前后，用流式细胞仪(FCM)测定DC表面CD80、CD83及CD86的变化，观察转染本身对DC表面标志物的表达有无影响。
117共转染基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pc D-NA310与pEGFP质粒后的表达测定制备IgHV1-GM-CSF/pcDNA310质粒的基因微载体子弹，并加入pEGFP(9B1)荧光质粒，以选定的最佳条件转染DC, 24h后提取RNA，用无RNA酶的DNA酶I消化处理后以RT-PCR方法测定IgHV1-GM-CSF的转录, ELISA方法检测GM-CSF的表达。zhiwang
118统计学处理数据以
洛桑灵智多杰x?s表示，采用CH ISS软件进行配对资料t检验及多组资料的方差分析。P< 0105为差异有统计学意义。
2结果
211获得携带质粒载体DNA的基因微粒子弹每次用75L g的质粒，可制备获得比较均匀的子弹40~45枚，经随机洗脱子弹测定DNA，每枚子弹含质粒量为0199?0106L g(n=3)，包被效率约为66%。IgHV1-GM-CSF/pcDNA310质粒子弹洗脱液经PCR扩增，获得正确的IgH V1-GM-CSF条带。
212基因转染DC条件优化基因激发时使用不同的氦气压力,DC转染质粒pEGFP后的转染率和细胞存活率见图1。压力在100~200psi(1psi= 61895kPa)时转染效果较好，但压力增大后DC中金颗粒增多，细胞死亡明显增加，因此选择120psi作为转染压力。同样方法选择PVP浓度为0102mg/ml、MLQ为015mg金/子弹、DLR为115L g质粒DNA/子弹，能够获得较好的转染效果。
213不同转染方法的比较3种转染方法转染DC后荧光质粒表达的荧光照片直观显示出转染效率的不同(图2)。电转染方法效率最高，可达4512%?516% (n=3)，但细胞死亡多，且细胞颗粒度增加，表达荧光的DC失去了多突触的形态而变成圆形。基因方法转染效率为1015%?214%(n=3)，细胞死亡少，培养后细胞仍保持较好的突触结构。脂质体方法的转染效率很低，仅能看到个别阳性细胞。三者转染效率存在显
著性差异(P <0101)。电转染和基因转染后24h DC 存活率分别为1512%?618%、5013%?1214%(n =3),
差异有统计学意义(P <0101)
。
214 基因转染对DC 表型的影响 DC 表面CD80、CD83及CD86阳性表达率在转染前分别为1512%?
617%、1311%?410%、7916%?1117%，转染后分别为1613%?317%、1216%?311%、8111%?1012%，转染前后差异无统计学意义(P >0105)，提示转染过程本身对DC 表面标志物的表达无明显影响。215 基因疫苗质粒IgHV1-GM -CSF/pcDNA310在基因转染后DC 中的表达 对照质粒组c DNA 表达为阴性，而IgHV1-GM -CSF 转染组cDNA 表达阳性(图3)。ELISA 检测显示，转染IgHV1-GM -CSF 质粒的DC 中GM -CSF 含量为28?6ng/106细胞，而转染pcDNA310的DC 中GM -CSF 含量为10?3ng/106细胞，差异有统计学意义(P <0105,n =3)
。
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图3 基因方法转染DC 后表达的鉴定
M 1DNA marker;11pcDNA310RNA;21pc DNA310cDNA;31IgH V1-GM -CSF RNA;41IgHV1-GM -CSF cDNA
Fig 13 Identification of the expression of Ig HV1-GM -CSF in DCs transfected by gene g un
3 讨 论
在病毒感染及肿瘤的DC 免疫中,DC 基因转
染是关键环节。目前，已有多种方法用于原代细胞诱导培养的DC 转染，包括脂质体转染、机械或电转染、病毒载体转染等。脂质体转染是基因转染中最经典也是最常用的方法，但体外获得的大量DC 是从PBMC 诱导培养而来的，细胞分裂少，因此很难将质粒顺利转入。虽然有文献报道脂质体转染可获得成功[3]，但本实验中脂质体Lipofectamine 2000转染DC 的效率非常低。采用病毒载体转染DC 可获得很高的转染效率[4]，但对于临床研究，安全性是首要考虑的因素，因此限制了其应用。电转染是目前研究中应用最多的方法，其主要缺点是细胞死亡较多。本实验采用改进的直接转核的电转染方法[5]，结果显示确实获得了满意的转染效率，最高可达50%以上。不足之处在于虽然采用了特殊的缓冲液系统增加对细胞的保护，但是转染后细胞死亡仍然较多，而且基本失去了DC 典型的多突触及微绒毛结构而变成圆形。细胞状态的这种改变对于发挥DC 抗原加工、呈递等功能可能产生不良影响。
基因颗粒轰击是利用瞬间高压氦气，直接将包被有DNA 或RNA 的微小金颗粒射入细胞中而达到转染的目的，较多应用于植物细胞的转染或动物经皮肤
直接免疫接种，也可用于多种体外培养细胞的DNA、RNA或者蛋白多肽的转移[6]。本实验中用于DC转染的Helios基因是一种便携式系统，主要包括子弹制备和细胞轰击两部分。探讨转染的条件须注意以下问题:¹需要选择合适的亚精胺、PVP浓度，以使质粒DNA尽可能地黏附到载体金颗粒上并均匀地涂布于管状子弹的内壁;º需要选择合适的金颗粒、DNA量及其比例，以降低转入时对细胞的损伤、增加转染效率;»选择合适的氦气压力是转染的关键，因为压力过小金颗粒不能进入细胞，而压力过大易损伤细胞，且有可能穿过细胞而不能达到携带DNA的目的[7]。在对上述各因素进行了优化后，基因转染DC的效率可达10%以上。
与电转染方法比较，基因转染DC效率略低，但转染后DC死亡明显减少，且经培养后DC仍能保持良好的树突状结构。FCM检测结果显示，基因转染过程本身对DC表面标志物的表达无明显影响，因此推测不会影响DC的功能。
选择基因颗粒轰击方法将基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA310转染入DC，在转录及蛋白翻译水平均证明转染的质粒DNA得到了有效表达。转染基因在DC中顺利表达是其发挥抗原加工、呈递从而诱发有效免疫应答的基础，本实验在选定的最佳实验条件下，成功实现了转染的目的基因在DC中的表达，提示基因颗粒轰击方法转染DC是细胞免疫中一种有效的选择。
=参考文献>
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cular and intradermal routes us ing a gene gun provides different mag-nitudes and durations on immune response1M ol Immunol,2003,39
(14):847
118114号码百事通
(2009-04-10收稿2009-05-04修回)化验室组织与管理
(责任编辑胡全兵)
#信息#
/全军及北方急诊危重症论坛0于2009年7月24-27日在沈阳召开。全军急诊专业委员会主任委员沈洪教授，沈阳军区总医院联勤部卫生部郭晓清主任，沈阳军区总医院吴英杰政委、医务部侯明晓主任出席开幕式，吴英杰政委致开幕词。本次会议共有参会代表451人，包括来自69家部队医院的代表319人,58家地方医院的代表126人，以及国外代表6人。会议共收到来自全军及地方各大医院的稿件132篇，其中专题讲座稿件35篇。
20年来，中国急诊医学已经有了突飞猛进的发展，急诊医学水平日益成为评价医院救治水平以及展示城市文明程度的重要标志。如何抓住机遇、迎接挑战，是广大急诊医学同道面临的共同课题。
在急诊医学服务体系中，院前急救、急诊救治、急诊加强医疗病房(EICU)这3条急救链环环相扣，不可或缺。急救链的成功建立不仅提高了临床急危重症患者的抢救成功率，而且为急诊教学、科研和人才培养提供了良好的平台。完善并提高急诊及危重症救治一体化水平，加强EICU临床医师对急危重症的救治能力，促进全国急诊及危重症领域的交流，是举办这次会议的主要目的。
本次急诊会议体现了急诊与危重症结合、部队与地方结合、医疗与护理结合的特点。会上共有31位专
家教授进行了专题讲座。解放军总医院沈洪教授，解放军总医院第一附属医院林洪远教授，解放军第309医院马朋林教授，北京协和医院马遂、于学忠、王仲教授，中国医科大学刘志教授，沈阳军区总医院王祖禄、高燕教授，新加坡陈笃生医院萧莱莱教授等国内外专家到会授课，对急诊与危重症问题进行了深入的交流与探讨。
本次盛会展示了急诊医学中的新亮点，推动了全军急诊及危重症救治工作的发展，为从事急诊与危重症的国内外同行提供了展示与交流的平台。
全军急诊专业委员会
2009年7月27日
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