-556•安徽医科大学学报Acta Unwersitatis Medicinalis Anhut2021Apr；56(4)
网络出版时间：2021-3-1312：37网络出版地址：htt p s://koski.pet/kcms/demil/34.1065.R.20910817.1520.210.htmi
LncRNA MEG3对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响李崔，郗玉巧0王少华1，杨金亮1，杨铁牛1，张永亮1，胡启飞1 摘要目的应用靶向长链非编码RNA母系表达基因3 (LncRNA MEG3)的过表达重组质粒来转染体外培养的人脑胶质瘤细胞，从而观察其对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法应用qRT-PCR法检测正常脑组织细胞(N)和胶质瘤细胞系U251中LocRNA MEG3mRNA的表达情况。构建PCI-MEG3真核过表达载体，转染体外培养的人脑胶质瘤细胞系U251，作为PCFMEG3过表达质粒组(pCI-MEG3组)；空pCI质粒转染体外培养的人脑胶质瘤细胞系U251，作为空载体pCI组(pCI组)；无质粒转染的人脑胶质瘤细胞系U251，作为空白对照组(ConeW组)。采用qRT-PCR分析LocRNA MEG3基因表达变化,Western blot法分析LocRNA MEG3相关蛋白MDM2和p53表达变化,MTT法和细胞克隆技术分析胶质瘤细胞增殖能力,T//sweP技术分析 胶质瘤细胞侵袭能力，流式细胞技术分析胶质瘤细胞凋亡率。结果与正常脑组织细胞比较，胶质瘤细胞中LocRNA MEG3mRNA表达水平降低。体外实验显示，与Copeci组和pCI组比较,pCI-MEG3组LocRNA MEG3mRNA及p53蛋白表达水平均有上调(P<0.05),MDM2蛋白表达下调(P< 0. 汤永宽45)，细胞增殖能力受到抑制(P<4.41)，细胞侵袭能力也受到抑制(P<4.01)，细胞凋亡率升高(P<4.01)o结论
人脑胶质瘤细胞中LocRNA MEG3的表达水平低于正常人脑组织细胞，靶向LocRNA MEG3基因的过表达重组质粒能够增加人脑胶质瘤细胞内LocRNA MEG3的表达，从而抑制 胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，同时增加其凋亡率。
关键词胶质瘤;LocRNA MEG3；增殖；侵袭；凋亡
中图分类号R739.41
文献标志码A文章编号1004-1492(2421)44-4556-46 doi40.17445/j.cukl.iss/1000-1029.2091.44.010
目前全世界范围内，高发病率、复发率及致死率的恶性脑胶质瘤是成人中最常见的中枢神经系统肿瘤。其手段是显微外科手术联合放化疗，但总体预后仍较差，绝大多数患者在术后2年内死亡9年生存率不足0%[1—7]o因此，肿瘤发生发展相关
2020-09-22接收
基金项目：安徽省自然科学基金(编号:1728055MH234)
作者单位5安徽医科大学附属阜阳医院神经外科，阜阳037002 0安徽汉库医学诊断技术有限公司质量部，阜阳036002
作者简介：李佳，男，硕士，副主任医师，责任作者，E-mail：94153232@qq 分子作用机制的研究和阐明，成为当前胶质瘤的主要研究方向。而能抑制肿瘤细胞增殖、侵袭能力及加速其凋亡的抑癌基因无疑是这方面研究的重点。长链非编码RNA(long non-coding,LncRNA)是一类不具备编码蛋白功能的RNA分子，近年来文献[-6]报道许多LncRNA在恶性肿瘤发生发展中参与调控其增殖、侵袭、凋亡等生物行为。母系表达基因3(mateuallp expressed gene3,MEG3)作为Ln-cRNA的成员之一，已有文献e-报道其具有抑癌功能，在多种恶性肿瘤中出现缺失或表达水平下降，而肿瘤细胞中的LncRNA MEG3高表达，可以抑制肿瘤细胞的增殖能力。但目前LncRNA MEG3对脑胶质瘤生物学功能影响报道较少。该研究旨在探讨其对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。
1材料与方法
1.1主要材料安徽医科大学第二附属医院神经外科收集了人正常脑组织细胞；人脑胶质瘤细胞株U201购自上海科学院细胞库；培养基DMEM s胎牛血清、胰酶消化液均购自美国Hyclo/v公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、脂质体Lipofectamine2200及qRT-PCR试剂盒均购自美国Invit/gen公司；RI-PA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体购自北京中杉金桥公司，包
括一抗：兔抗人MDM9s p03，羊抗人GADPH多克隆蛋白抗体；二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗羊-G、羊抗兔IgG；MTT及细胞凋亡试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；pCI真核表达载体购自上海艾博思生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.2RNA提取与RT-2CR检测细胞中LncRNA MEG3表达变化将组织和细胞匀浆后，根据试剂盒操作步骤，采用TRFol法提取细胞总RNA，并使用反转录试剂盒合成cDNA o以cDNA模板进行PCR反应扩增,LncRNA MEG3引物序列：F：5UAT-CATCCGTCCACCTCCTTGTCTTCAU R：5'-GTAT-GAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3'；内参GADPH弓|物序列：F：0UTGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3U R：
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5^-ggttgagcacagggtactttd r0应用荧光定量PCR仪7700型软件进行定量检测，利用2公式所得到的数值来衡量LncRNA MEG3mRNA的表达强度。
1.0.0质粒载体构建与细胞转染将PCR扩增的LncRNA MEG3cDNA序列亚克隆到p CI真核表达载体中，进而构建成p COMEG3过表达质粒。U251细胞培养：在DMEM培养液（含105U/L青霉素、17%
灭活的胎牛血清、100mg/C链霉素）中常规培养，且培养箱为37C恒温,5%CO-的饱和湿度。用0.25%胰酶每2d消化传代一次。U251细胞处于对数生长期时消化处理并离心（5md、1000 r/min），加入适量DMEM培养基（仅含胎牛血清、无抗生素）并计数，在培养瓶中按5xl05/ml密度接种。接种24h左右待细胞长至培养板80%以上时进行转染。将U251细胞随机分3组，前两组用脂质体Lipofectamine2000分别转染pCI-MEG3组和pCI组‘Control组加入PBS o经过转染48h后，利用qRT-PCR检测3组细胞中LncRNA MEG3mRNA的表达量，方法参照上述0
2.1。
1.0.3Western blat检测U251细胞中LncRNA MEG3相关蛋白表达变化用胰酶消化转染48h 后的3组U251细胞，预冷的PBS轻轻晃动清洗3次,PBS弃净，RIPA裂解细胞，提取3组细胞总蛋白，并进行蛋白定量（BCA法）。然后根据SDS-PAGE上样电泳将3组蛋白转膜（PVDF膜）处理，并用封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST溶液）室温封闭2~3h,—抗孵育17h，二抗孵育2h o按照Super Signal West Pica Chemiluminescent Sudstrate Kit曝光显影，使用Synaene Bia Imaydg软件进行图像分析。
1.0.0MTT检测细胞生长情况将转染后的3组U251细胞接种于96孔板，接种密度为1xl76/孔，进行常规培养。分别培养0、12、2448h后，弃去培养基，加入MTT（5mg/mi）17m H孔,37C继续孵育,h后终止培养，吸弃孔内培养液，每孔再加入分析纯的DMSO104m H放置酶标仪振荡5md，用分光光度计测定492nm下的吸光度值A o纵坐标为细胞存活率，横坐标为时间，绘制细胞生长曲线。
1.0.0细胞克隆技术检测细胞增殖情况将转染后的3组U251细胞接种于6孔板，接种密度约为220个/孔，加入培养液05mH孔，放入培养箱继续培养。每2U换一次液，观察细胞生长状态。7U后吸弃培养液，每个孔内放入多聚甲醛（4%）1ml固定30min后，吸弃固定液，每个孔内加入洁净的吉姆萨染料0.5mi染细胞大约25min。小心弃去孔中的染料，将6孔板竖直缓慢在自来水中反复漂洗数次，静置晾干，置于显微镜下拍照并进行图像分析。
1.2.6TmksweP技术检测细胞侵袭情况配置基质胶与无血清培养基比例为1:3的配置液，取54 M；配置溶液加至TmksweP小室聚碳酸酯膜的上室面，置于37C4%CO2培养箱内，慢慢风干直至呈凝胶状态。将转染后的细胞制备单细胞悬浮液，显微镜下观察并计数，取约1x105个细胞,200m；无血清培养基加入TranspeP小室上室，下室中加入540m；含胎牛血清培养液，置于37C4%CO2培养箱内培养,0h后，取出小室，并用PBS轻轻漂洗2次，再进行30min的甲醇固定，适当风干后，无菌棉签轻轻擦去上室底部膜表面上的细胞，保留下室的细胞，结晶染液染10mik，在显微镜下计数。1.0.0流式细胞技术检测细胞凋亡情况3组U251细胞转染48h后，收集各组细胞，用PBS洗涤2次后加入binding buffer（540m H，加入5M；Annx- ine-BITC和5m；PropiUiumloPiPe，轻轻吹打混匀，避光室温孵育30min，上机（BD流式细胞仪）检测细胞凋亡。
1.0统计学处理所有计量资料均用x±i表示，对所得数据用SPSS11.0统计软件处理及统计学分析，两组间差异比较采用单因素方差分析或i检验法。
2结果
2.1qRT-PCR检测正常脑组织细胞（N）和U261细胞LncRNA MEG3基因的表达qRT-PCR结果显示，在mRNA水平上胶质瘤U251细胞系中Ln-cRNA MEG3的表达量低于正常脑组织细胞（N），提示LncRNA MEG3在胶质瘤U251细胞系中低表达。
2.1qRT-PCR检测U261细胞LncRNA MEG3基因表达变化细胞转染48h后,qRT-PCR检测Ln-cRNA MEG3转染效果显示，pCI-MEG3组LncRNA MEG3的表达水平高于Control组（i=9.09,P< 0.01）和pCI组（i=9.02,P<0.01），差异有统计学意义。见图1。
2.3Western blot检测U261细胞LncRNA MEG3相关蛋白表达变化Westem blat结果显示, 3组内参GADPH蛋白的表达相近，pCI-MEG3组MDM2蛋白表达低于Control组（=2.18,P<0. 05）和pCI组（i=2.29,P<0.05）,p53蛋白表达高
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于 Coptui 组(i = 2. 65 , P < 6. 60)和 pCI 组(i 二
2.56,Pv6. 65)，差异有统计学意义。见图2o
1086
42
较,pCFMEG3组细胞生长受抑制，差异有统计学意
义(F = 16. 52,P<6. 60)；转染 43 h 后，与 Coot/i
核心价值观
组和pCI 组比较,pCFMEG3组细胞生长明显受抑
制，差异有统计学意义(F = 17.94,P<6. 61)o 见 图3o
赵东宛
0.8
Control 组pCI 组 pCI-MEG3组
Control 组
pCI 组 pCI-MEG3 组和
MDM2
p53
GAPDH
图1转染后各组胶质瘤U261细胞LncRNA MEG3的表达情况与 Control 组和 pCI 组比较：* * P <2.21
95
53
36
0.6
0.4
0.2
Control 组pCI 组 pCI-MEG 3 组
0.01.5
图2转染后各组胶质瘤U261细胞MDM2和p63蛋白的表达情况
与Control 组和pCI 组比较：* P<2. 25
2・3 MTT 法检测LncRNA MEG3基因对U261细 胞增殖的影响 MTT 实验结果显示，与Copt/i 组和
pCI 组比较9CFMEG3组在转染16 h 后细胞生长无
显著差异o 转染24 h 后，与Codt/i 组和pCI 组比
.2.0.8.6
.4.2.0L L a a o.a
(％)ffl te 凰S 1
^1
Control 组pCI 组pCI ・MEG3 组
图3转染后各组胶质瘤U261细胞在不同时间点增殖生长的情况
与Control 组和pCI 组在同一时间点比较：* P < 2. 05 , ** P <
2 21
2.3 细胞克隆实验检测LncRNA MEG3基因对
U261细胞增殖的影响 将细胞克隆后的6孔板在
显微镜下观察o 1周后在显微镜下观察3组细胞克 隆增殖情况，与Coot/i 组和pCI 组比较,pCI-MEG3 组细胞增殖低于Coptui 组(i = 17. 08,P<6. 61)和 pCI 组(i = 16.95, P<6. 61)，差异有统计学意义。
见图 4。
pCI 组
PCI-MEG3组
Control 组
图4转染后各组胶质瘤U261细胞克隆增殖的影响情况 x 02
日体艺术
与 Control 组和 pCI 组比较:** P <2.21
2・6 Transweli 实验检测LncRNA MEG3基因对
U261细胞侵袭的影响Traoswell 实验结果显示，细胞培养43 h 后，在显微镜下计数3
组细胞中下室细
安徽医科大学学报 Ada Univer 3110.13 Medicinalis Anhui 2621 Aps ；56(4)
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Control 组
pCI 组
pCI ・MEG3组
胞的数量。pCI-MEG3组细胞数低于Control 组(i =
9.44,P<0. 01)和 pCI 组(i=9.63,P<0. 01)，差
异有统计学意义。见图 5。
200
150
100
50
Control 组pCI 组 pCI-MEG3 组
图6转染后各组胶质瘤U261细胞侵袭能力的影响情况 x466
幼学纪事
与 Control 组和 pCI 组比较:* * P<2.01
2.7 流式细胞术检测LncRNA MEG3基因对
U261细胞凋亡率的影响流式细胞术检测结果显 示，细胞培养48 h 后,p COMEG3组细胞凋亡率高于
Control 组(=13. 17,P <0.01)和 pCI 组(i = 13. 88,
P<0.01)，差异有统计学意义。见图5o
3 讨论
LncRNA MEG3位于人类染体14q32. 0位点,
是一个全长约为1 700个核苷酸的母源性印记基因,
它也是第一个被发现具有肿瘤抑制作用的LncRNA两房退市
74］o LncRNA MEG3在许多正常组织中高表达，而 在包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤 组织中低表达甚至不表达70 ］ o 近几年有研究72］表
明LncRNA MEG3在不同分期和组织学分级肿瘤中
的表达存在差异，在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和
凋亡等生物行为中扮演重要角，在临床上和患者
预后密切相关。因此，目前LncRNA MEG3常被临 床研究上选择作为抗肿瘤药物的重要分子靶点，是
控制基因可行性的关键因素之一。而启动子或
基因间差异甲基化区域的超甲基化可能是导致肿瘤
细胞中LncRNA MEG3低表达或表达丢失的主要原
因75 ］。同时，有学者在文献70-7 ］中提出肿瘤细胞 中的LncRNA MEG3高表达，可以抑制肿瘤细胞的
增殖能力，且LncRNA MEG3抑制细胞增殖能力和 诱导细胞凋亡部分原因可能是通过抑制MDM2的
表达，随后激活p53信号途径。
该研究借助LncRNA MEG3过表达重组质粒载
体转染人脑胶质瘤细胞的体外实验，来增加细胞内
LncRNA MEG3基因表达量，随后探讨其对人脑胶质
瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。研究结果显示，在
FL3 Log FL3 Log
105
图6转染后各组胶质瘤U261细胞凋亡的影响情况
与 Control 组和 pCI 组比较:* * P<2.01
o
Control pCI
pCI-MEG3
-546-安徽医科大学学报Acta UniversPaO Memcinalie Anhut2271Apr；56(4)
mRNA水平上胶质细胞中LncRNA MEG3的表达量明显低于正常脑组织细胞，提示LncRNA MEG3可能
是脑胶质瘤的一个潜在独立的诊断标志。同时，研究结果表明LncRNA MEG3基因的异常表达与胶质瘤发生、发展关联紧密，过表达细胞中LncRNA MEG基因后，可以抑制人脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，同时增加其凋亡率，这为脑胶质瘤临床基因提供了新的思路和理论依据。
然而对于LncRNA MEG3基因仍存在许多问题需要进一步探讨和研究，如胶质瘤细胞中LncRNA MEG3基因的确切调控机制和调控路径、LncRNA MEG基因与胶质瘤发生发展相关的其他基因之间的相互作用及与LncRNA MEG3基因相关的体内实验结论等。进一步深入研究这些问题，能够为在基因水平上寻新的分子靶向方案奠定理论基础。
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The inUuence of LncRNA MEG3on proliferotion,
invasion and apoptosis of human glioma cells
Li Jia1,Xi Yuqiao2,Wang SUaokua1,et at
((Depi of Fuyang Hospitai ef Ahiut Memcal Uhveuhy,Fuyah230602;
2Depi of Quality,Anhid Hannt MPicai DCghfc Tecinolopa Co.LTD,Ftyah236000)
Abstroct Objective To oksema its effect on the pmUOmtin,invasion and apoptosis of humgh glioma celts by the overexpression recombinant plasmid tarfeting te hng kou-coding mateeialiy expressed gene3(LncRNA MEG3) gene transfects the humgh glioma celts tn vitrs.MChodu The expression of LncRNA MEG3mRNA in normal brain tissue cells(N)and glioma celt line U251celts was detected by qRT-PCR.EuPa/otic overexpression vector ofpCI-MEG3was censtwicte/te transfect the humgh glioma celt line U251celts as pCOMEG3overexpression plasmid ymup(pCOMEG3ymup):Those transfected with empty pCI plasmid were di v ide/inta empty vector pCI yroup(pCI ymup)and those without aky transfection were Oivided inta Control ymup.The expression of LncRNA MEG3gene was analyzed by qRTCCR.The expression of MDM2and P53of LncRNA MEG3-related protein was confirmed by
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