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作者：单铁英苏安英唐军民
nk【摘要】 目的：通过电穿孔法将带有增强型绿荧光蛋白基因
(enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体
plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体
进入位点 2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den dritic Cell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。 方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞， 采用细胞因子体 外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选 择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、 DNA剂量等。应用电穿孔仪将
PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分 别计算绿荧光阳性细胞数和总细胞数。0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染，计数电转染后细胞存活率。结果：当 imDC浓度为5X 106/mL
禁娱令与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h山丹地震最新消息明显表达， 48 h后表达最强。结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的 细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC
可使目的基因获得较高的转染率， 且细胞死亡最少。电转染提供了外
源基因转染imDC的可行技术。
【关键词】电穿孔转染绿荧光蛋白树突状细胞
Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfacted
into immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency
and survival rate of immature dendritic cells in different con diti on s.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs
in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified li.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survival
rate were counted.Results:Electransfection efficiency was
in creased to the highest value whe n imDCs with the
concentration of 5X 106 cells/mL were mixed with 60 卩 g-total
DNA,the electric voltage of electroporation apparatus was set at 300 V,and the time of im
pulse was 500 卩 s.There was
sig ni fica nt and the highest expressi on of plRES2-EGFP
respectively at 24 h and at 48 h after tran sferri ng.C on clusio n:A higher tra nsfecti on efficie ncy of target genes can be obta ined by means of electroporati on with suitable electric conditions.Electric transfection provides a
tech ni cal possibility to make DNA into imDCs.
Key words Electroporati on; Tra nsfect;Gree n fluoresce nt
protein;Dendritic cell;Human
树突状细胞（dendritic cell,DCs ）作为体内惟一能活化初始 T细 胞的抗原递呈细胞（antigen presentingcell,APC） ，是激发机体特
异性免疫反应的关键，其在抗肿瘤免疫领域中的作用受到广泛关 注，以DCs为基础构建的各种类型的疫苗在多种肿瘤免疫的基础 和临床研究中显示了旺盛的生命力和良好
的前景[1,2] 。本研究
半方差函数应用电穿孔仪将plRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，探索外源 基因转染imDC的优化条件。
1材料与方法
1.1材料与器材
PIRES2-EGFP质粒（Clontech 公司）、Wizard 质粒抽提试剂盒 （Promega公司）,Hinc H酶（Takara公司）。健康人新鲜外周血，购自 北京市血库。RPMI-1640培养液，美国GIB公司产品。淋巴细胞分离 液（Ficoll ，1.077 g/mL ），上海试剂二厂产品。胎牛血清（FCS， 新生牛血清（NCS）,美国HYClone公司产品。重组人粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子(rhGM-CSF和重组人白细胞介素 4 (rhlL-4 ),肿瘤 细胞坏死因子a(TNF-a)、购自德国RD公司产品。电转染仪BTX-830, 购自北京基因公司。
1.2质粒的制备及鉴定
将plRES2-EGFf质粒转化感受态TOP1(大肠杆菌，取菌液20卩L接 种到5 mL含100卩g/mL卡那霉素的LB培养基中。在37 C摇床上 剧烈震荡培养过夜。按照Wizard质粒抽提试剂盒说明书用碱裂解法 提取、纯化质粒 DNA紫外分光光度测 OD260nm： OD280nm=1.8,证 明质粒纯。测浓度为0.4卩g/卩L,保存于-20 C备用。取少量质粒 用Hine stc89c52单片机H酶切，0.9%琼脂糖电泳鉴定酶切结果，验证该质粒是否确 为 pIRES2-EGFP
1.3imDC的获取
取正常人新鲜外周血200 mL,以淋巴细胞分离液分离外周血单个核 细胞(PBMN)在37 C和5%CO饱和湿度条件下培养2 h，取贴壁 细胞即单核细胞(pDC，并测其纯度，调整细胞浓度为2X 106/mL加 入RPMI-1640液、10呱台牛血清(FCS和细胞因子rhGM-CSF(1 000 U/mL); (rhIL-4)500 U/mL 于37 C和5%CO饱和湿度条件下培养。 第7 d收获的细胞为imDC用免疫细胞化学的方法显示细胞表面共 刺激分子CD80 CD86及 HLA-DR计数阳性细胞。
1.4电穿孔法转染树突状细胞
1.4.1不同电压条件下转染imDC根据北京基因公司提供参数及操
作程序将PIRES2-EGFP质粒转入imDC选择脉冲时间下400卩s，细 胞浓度ix 新上海影都106/mL、DNA剂量2卩g不变，电压分别为200 V、300 V、
400 V条件下进行瞬间和稳定电转染。电穿孔缓冲液为 RPMI-1640培
养液；电转杯体积0.8 mL，将0.4 mL细胞悬液与plRES2-EGFp质粒 混合均匀进行电转染，电穿孔后 30 min加入含20%胎牛血清的
RPMI-1640培养液，置37 C、5%CO培养箱中培养，同时以未转染 的imDC为空白对照。
1.4.2不同脉冲时间下转染imDC选择电压为300 V，细胞浓度1
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