曾智凤，易著文*，黄丹琳，曹艳，何庆南，吴小川，党西强，何小解，莫双红中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室，湖南长沙 (410011）
E-mail：zengzhifeng198129@163
摘要：本文采用密度梯度离心法分离培养BMSCs，诱导培养液诱导其向成脂肪方向分化，并行细胞表面抗原鉴定，及油红O染评价细胞成脂肪情况。在此基础上，采用逆转录病毒pLEGFP-N1对细胞进行绿荧光蛋白标记，观察细胞形态学改变及荧光表达的时间与强度，计算转染率，以期探讨绿荧光蛋白标记SD大鼠BMSCs的可行性，为细胞移植寻一种理想的示踪标记方法。实验结果显示细胞扩增迅速，形态良好，纯度较高，经诱导后细胞内可见脂滴。逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记SD大鼠骨髓间充质干细胞，并对4周体外培养进行了良好的标记。因此认为逆转录病毒pLEGF-N1转染效率高，转染成功的BMSCs可以长期稳定表达目的基因，是一种理想的病毒载体。荧光蛋白标记技术可以作为种子细胞良好的示踪标记方法。 黑龙江省畜牧研究所
关键词：骨髓基质干细胞；成脂肪诱导；增强型绿荧光蛋白
1. 引言
骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有自我更新、多向分化潜能，且容易获取及体外扩增培养，成为近年来成体干细胞研究的热点[1..2]。深入认识BMSCs植入受体后的生物学行为，对于探索其作用机制至关重要，这就需要有效标记BMSCs。随着人们对增强型绿荧光蛋白（EGFP）研究的逐渐深入，为解决这一难题提供了可能。本实验旨在探讨逆转录病毒pLEGFP-N1转染BMSCs的可行性，进而寻一种较为理想的细胞示踪标记方法。
2. 材料与方法
2.1材料
清洁级SD大鼠（150g），由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。F12/DMEM，DMEM 培养基，胰蛋白酶，胎牛血清为Hyclone公司产品。Ficoll-Paque淋巴细胞分离液为Pharmacia 公司产品。逆转录病毒pLEGFP-N1，质粒提取试剂盒，脂质体，PT67包装细胞株BD，G418、Polybrene，核酸内切酶HindⅢ，地塞米松、IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、胰岛素、吲哚美辛，PE-CD29、fitc-CD34分别购自Clontech、Promega、Amresco、Biosciences、Aldrich、Takara、Sigma、Pharmigen公司。
2.2实验方法
2.2.1 BMSCs培养、成脂肪诱导、表面抗原鉴定
2.2.1.1原代、传代培养：取SD大鼠，无菌条件下取出股骨、胫骨，暴露骨髓腔，DMEM冲洗骨髓腔，使用Pharmacia分离液（密度1.073g/ml）进行梯度离心（2000r/min×20min），吸取界面层细胞，洗涤两次后，按5×105/cm2密度进行原代培养。48h首次换液，去除杂细胞，得到较纯的贴壁MSCs。传代培养：当细胞长满80％瓶壁面积时，胰酶消化，细胞变圆时终止消化，制成单细胞悬液后以1：1比例传代，取第3代细胞进行鉴定和标记实验。培养基为
1本课题得到国家自然科学基金（项目编号:30672251）的资助。
含10％的胎牛血清低糖型DMEM，置于37℃、饱和湿度的5％CO2孵箱中培养。
免疫组化评分2.2.1.2间充质干细胞鉴定：①成脂肪诱导分化、油红O染鉴定：成脂肪诱导培养液：地塞米松（10－6mol/L）＋IBMX（0.5mmol/L）＋胰岛素（10µg/ml）＋吲哚美辛（100µg/ml）＋HG-DMEM（含10％FBS），每3天换液，诱导3周后，行油红O染分析，具体如下：消化细胞接种于含预处理小玻片的24孔培养板内，24h后取出小玻片经PBS漂洗后用甲醛－钙固定液固定30min，进行油红O染。
甘油胶封片，置显微镜下观察。②表面标记鉴定：胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤2次，分别加入PE或FITC荧光标记的CD29、CD34流式抗体，4℃孵育30min，流式细胞仪检测。
2.2.2质粒提取、酶切、连接、转化及鉴定
参照文献[3]的方法，先对感受态细菌的DH5α进行转化，铺氨苄青霉素抗性平板，选菌落进行过夜扩增，再利用试剂盒从细菌中抽提质粒，然后HindⅢ酶切质粒4h，琼脂糖电泳鉴定。
2.2.3增强型绿荧光蛋白包装细胞株的构建
以逆转录病毒pLEGFP-N1为载体，EGFP基因为标记基因，用脂质体介导转染包装细胞PT67经400-600µg/mL的G418筛选出抗性克隆，用NIH3T3细胞，经G418抗性检测病毒滴度达到2×105cfu/ml
2.2.4逆转录病毒转染SD大鼠BMSCs
收集新鲜高滴度包装细胞株PT67/EGFP－N1上清，用0.45µm的滤膜过滤，再加入终浓度为6µg/ml的Polybrene组成转染液。收集第3代SD大鼠BMSCs，按1-2×105个/孔接种于6孔板中，常规培养12-16h后，加入上述转染液，培养24h后更换新鲜培养基，继续培养48h，G418筛选出阳性克隆。
3. 实验结果
3.1成脂诱导培养
BMSCs在成脂肪诱导培养后细胞形态变得不规则，诱导2周后即可见部分细胞胞内出现数目不等的折光性强的脂滴形成，到3周后可见大部分细胞有脂滴聚集，部分细胞被脂滴充满。（图1）
douludalu
盐酸图1 成脂诱导后的油红O染显示图2 BMSCs表面分子：CD29、CD34的较多脂滴（×400）流式细胞仪测定结果
3.2细胞表面抗原鉴定
BMSCs 表达CD29为（65.15）％，而CD34（10.5％）。（图2）
3.3质粒鉴定
pLEGFP-N1（6.89Kb ）含Hind Ⅲ单一酶切位点，提取质粒经Hind 酶切后琼脂糖电泳，结果与预期值一致。（图3）
1 2
1：pLEGFP-N1（Hind Ⅲ）；2：Marker 图4 逆转录病毒pLEGFP-N1转染
图3 pLEGFP-N1质粒的酶切鉴定 BMSCs 后1周的表达（×200）
3.4逆转录病毒方式标记
pLEGFP-N1质粒转染PT67细胞后36h 观察到EGFP 表达，经G418筛选后，超过90％的PT67细胞表达EGFP 。转染BMSCs 后2d 普通显微镜下计数细胞数，同视野下换用蓝荧光激发光源观察，计数阳性细胞数，计算阳性细胞数与该视野下细胞总数的比值，每孔细胞计数4个视野，取平均值，即为此孔细胞pLEGFP-N1的转染率；。同法计算转染后1、2、3周的平均转染率。BMSCs 转染后2d ，普通显微镜下可见细胞形态改变，部分细胞较未转染前变圆，梭形处收缩；换用蓝荧光激发光源观察可见个别细胞出现绿荧光，即为表达阳性细胞，荧光强度极弱。G418筛选1周时未感染细胞逐渐死亡，随换液而清除，普通显微镜下观察可见细胞形态较前无明显变化，阳性细胞数增多，荧光表达增强。3周时转染率超过60％。传代后阳性细胞比值无明显减少，荧光强度维持在传代前水平，高水平表达EGFP 。转染后4周荧光强度无明显减弱，完全可以满足细胞示踪标记的需要。（图4）
4. 总结
在干细胞移植工程的重要组成部分中，种子细胞是其中最基本和重要的环节之一。BMSCs 具有取材方便和多分化潜能等特点，被认为是一种理想的种子细胞来源，广泛用于各个方面。而种子细胞在体内中究竟起何作用，亦未见明显的证据证实，尚需有效的细胞示踪方法对其在体内的作用机制进行进一步研究。细胞的示踪标记一直是困扰干细胞移植机制研究的一大难题，尤其在干细胞来源的种
子细胞作用机制研究中尤为重要。目前研究中所采用的示踪标记方法存在很大缺陷，如荧光素、Hoechst33342等标记时间短且污染周围组织；Y 染体标记虽然效果较好，但技术要求高，操作复杂，花费高，并不适合干细胞研究中的大量应用。EGFP 逐渐引起人们的重视[4、5]，本实验采用逆转录病毒EGFP ，可以高效转
昆虫病毒
5000bp 7500bp
染BMSCs，随时间的延长，表达无明显减弱，保证了EGFP的长效稳定表达，完全可以满足细胞体内示踪的需要，是一种理想的示踪标记方法。
参考文献
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大卫波德维尔
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Retroviral-mediated efficiency expression of enhanced green fluorescence protein in rat bone marrow stem cells Zeng Zhifeng, Yi Zhuwen*, Huang Danlin, Cao Yan, He Qingnan, Wu Xiaochuan,
Dang Xiqiang, He Xiaojie, Mo Shuanghong
Division of Pediatric Nephrology, Department of Pediatrics, The Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan, China（410011）
Abstract
Density gradient centrifugation culture was conducted to obtain rat BMSCs which were then induced in the adipogenic direction. their surface antigen and the adipogenic-differentiation potential were detected by red oil O staining。On the basis of the above results,BMSCs were transfected with the recombinant retrovirus pLEGFP-N1 containing enhanced green fluorescent protein(EGFP)..The mor
phologic changes of the cells,the expression time and intensity of fluorescent light were observed,The transfection efficiency was detected.evaluate the possibility of labelling SD rat bone marrow stromal cells with green fluorescent protein so as to seeking an ideal cell tracing mark for cell transporting.Results as following, The morphology and purity of the rat BMSCs obtained were good.The adipocyte was significant after adipogenic induction.EGFP was successfully expressed after BMSCs were transfected with the retroviral vector pLEGFP-N1.The labeled cells were easy to observe within four weeks. We concluded that retrovirus is an ideal vector for its high transfection efficiency ,and long expression period of the fluorescent light.The technique of seeding cells labeled with fluorescent protein is good at monitoring the seeding cells.
Keywords: Bone marrow stromal cells(BMSCs); adipogenic induction; Enhanced green
作者简介：
曾智凤，女，1981-01-29生，江西萍乡人，汉族，博士研究生，主要从事小儿肾脏病研究；易著文（1946-），男，湖南华容人，教授，博士生导师，通讯作者，主要从事小儿肾脏病研究， E-mail：yizhuwen@yahoo。
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