摘要
刘易斯模型
慢病毒载体(LV)在获得性及遗传性疾病的基因中的应用越来越广泛。这篇综述介绍了生产这些载体最前沿的技术，尤其是涉及到临床应用的大规模生产技术。相比较于在稳定细胞系生产的逆转录病毒载体，临床级别的慢病毒大多是通过在细胞工厂瞬时转染293或293T细胞生产的。然而，最近的进展倾向于采用中空纤维管反应器、悬浮培养及改进的稳定细胞系生产。正如生物技术行业的惯例一样，慢病毒生产已经建立了比较复杂的下有处理规程，包括去除任何过程来源的污染如质粒、宿主细胞DNA或蛋白。这篇综述比较了已发表的慢病毒大规模生产和纯化工艺并介绍了它们的优缺点。此外，稳定细胞系领域的进展及它们作为临床材料生产载体的进展也一并介绍。人人微博
前言
随着欧洲第一个批准AAV1载体用于脂蛋白脂酶缺乏(Glybera)，基于病毒载体的基因将会越来越多地应用到罕见、获得性疾病的。根据的目的及靶向细胞或组织的不
同，会优先选择一种质粒系统。如果应用在分裂的细胞或组织中，为了达到转基因的长效表达一般需要用整合型载体。传统上，逆转录病毒载体是很好的选择，因为它们可以将基因稳定整合到细胞中。目前开发的逆转录病毒载体系统主要有两种：来源于猫白血病病毒的γ-逆转录病毒(MLV)和主要来源于HIV-1的慢病毒载体(LV)。过去很多成功的临床实验采用的是基于MLV的载体，虽然现在这个载体还在用，但是趋势是倾向于采用慢病毒载体。这种转变的原因由很多：(i)与γ逆转录病毒相比，慢病毒因为可以跨过细胞膜所以可以转染非分裂细胞。(ii)慢病毒的整合模式有别于MLV载体，在引入插入突变方面似乎比MLV安全。(iii)慢病毒可以获得比较高的滴度。
这些就是逐渐由MLV转向LV的主要原因，只是目前LV载体整体的生产条件还没有达到最大潜能及MLV载体的水平。
曾昭科LV载体已经成功地应用于临床实验，尤其是免疫缺陷、神经退行性贮藏疾病等罕见病的。
然而，LV在遗传或获得性疾病包括β-地中海贫血、帕金森氏症及用于癌症的基于嵌合抗原受体的免疫在临床已经获得评价并获得了令人惊喜的结果。这意味着，鉴于
这些新疗法的逐渐变为常规使用，其生产技术成为一个关键问题。
基于发表的公共信息资源，这篇综述介绍了LV载体生产的实际水平、实际操作规程及仪器设备的优缺点、所能达到的最高的生产水平，最后对以后的发展进行了展望。
LV载体系统
LV载体系统的原型是已经深入研究的人类病毒，HIV-1。除了HIV-1之外，其它慢病毒也被作为基因转移载体（TV）来开发，但是它们绝大多数没有达到临床研究的水平，例如HIV-2、猿免疫缺陷病毒、非灵长类慢病毒包括猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、山羊关节炎脑炎病毒。只有基于马传染性贫血病毒的载体被开发到临床应用。 下面这篇综述将聚焦在基于HIV-1的LV载体。
四质粒系统
视域主要是考虑到HIV-1对人的病原性及相关的安全考虑，研究人员开发了不同代的LV载体系统，其中目前第三代被广泛应用在研发及临床中。它是一个4质粒系统，包括三个辅助质粒
和一个转移质粒。辅助质粒的选择取决于对分裂基因组进行包装合理设计，参见Dull的描述21信托公司集合资金信托计划管理办法。这个生产系统与临床安全应用的所有必需特性相关联（采用非重叠的、分裂基因组包装载体来最大程度地减少潜在的重组事件，这种重组事件可能导致有复制能力的病毒的产生）。HIV-1所有非必需基因(vif,vpr,vpu,nef)仅仅在第一代载体中保留，第三代慢病毒载体已经将它们去除。与此类似，在第二代慢病毒载体中保留的调节性的tat基因在第三代中被去除，因为它的反式激活功能不是必需的，因为转移载体中5’长末端重复中的U3启动子已经被一个组成型激活的启动子序列所替代，如巨细胞病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子加可选择的增强子或者可诱导/抑制的启动子序列，如7tetO26南通东方中学。这通常被说成是pRRL设计(转移载体包含嵌合劳氏肉瘤病毒，(RSV)-HIV5’LTRs)或者pCCL设计((CMV)-HIV5’LTR)。这些修改产生了需要辅助质粒的慢病毒系统，这些辅助质粒是基于来源于HIV-1的gag-pol（编码结构蛋白和病毒酶）和rev(编码翻译后调控元件)及env。虽然慢病毒载体可以用不同的异源膜糖蛋白包裹成假病毒，但是所有大规模(临床级)制备的载体所用的糖蛋白都是水泡性口炎病毒膜蛋白(VSV-g)，这是因为它在下游处理时稳定性高以及比较广的转染谱。
转移质粒是唯一转移进靶细胞的遗传物质，包括待转的基因表达盒、包装、逆转录和整合
所必需的顺式作用原件。考虑到提高生物安全性，自我失活的慢病毒载体也被开发出来，在这个载体中，3’LTR中的U3元件引入了缺失突变。这种载体一旦被转入靶细胞就丧失了病毒LTR的转录活性，从而使得产生有复制能力的重组子的风险最小化，同时也避免了启动子干涉相关的问题。
至于载体的生产，将四个分别编码gag-pol、rev、VSV-g及带有转基因及内部启动子的自激活型慢病毒转移质粒共转染HEK293或HEK293T(见下面)(Figure 1)。
慢病毒载体其它方面的安全性提高还有去除载体基因组中的同源序列，因为包装信号(Ψ)通过密码子优化延伸到了gag基因的第一个碱基及gag-pol载体。密码子优化使得gag-pol蛋白的翻译不再依赖于rev，因此Rev反应元件(RRE)序列可以从包装载体中去除。因为转移载体中含有部分gag序列，对gag-pol序列的密码子优化可以使得Ψ-gag重组(例如Sastry所报道31)变得不可能。密码子优化的另一个优点是可以使潜在的重组概率降低100倍。
转移载体中缺失RRE序列的完全不依赖rev的慢病毒载体系统目前还没有出现。RRE(未拼接的载体转录本的一部分)存在于多个Rev分子组装的寡聚复合体，该复合体可以稳定并介导载体转录本在载体生产时而不是转移载体在靶细胞整合之后从细胞核到细胞浆转运。可
选择的转运序列如组成型运输元件或RNA运输元件可以在gag-pol生产时发挥作用，但是尚未证实在转移载体中与RRE一样高效。因此，目前慢病毒载体仍然利用Rev/RRE来高效的将载体基因组转移到细胞浆。
Figure 1.一个Tat非依赖的第三代HIV-1载体系统示例。上图所示的SIN转移载体含有的cPPT可以高效核转运，MSCV LTR启动子作为内部启动子及WPRE元件驱动转基因高效表达。另外三个质粒分别编码HIV-1 gag-pol、rev蛋白及VSV-g膜糖蛋白。SIN：self inactivating, 自失活；VSV-g：水泡性口炎病毒膜蛋白。
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