最近⼏年基因领域⼤动作不断，⽆论是基因药物的陆续上市，还是各⼤豪门药企（如诺华、罗⽒、吉利德、辉瑞、GSK 等）不断加码基因的买买买，每隔⼀段时间就会有个⼤新闻抛出来。
基因的核⼼是基因载体，⽬前病毒载体占据着绝对主导地位。从世界上第⼀个腺相关病毒（AAV）基因药物Glybera，到 GSK 的慢病毒（LV）基因药物 Strimvelis，再到诺华的⾃体回输 Car-T 细胞和 Spark 的Luxturna，AAV 和 LV 总是霸占头条，⼀时瑜亮。由于 AAV 和 LV ⼤都采⽤质粒瞬时转染⽅法⽣产，⾼质量、⾼纯度的超螺旋质粒是制备 AAV、LV 等病毒载体的前提条件。 质粒，⼀段⿇花样的环状超螺旋 DNA是常见的分⼦⽣物学⼯具。抽提质粒⼏乎是每个⽣物⼈的必备技能之⼀。抽提试剂盒可以提供微克⾄数毫克级的质粒，⾜以满⾜科研需求；但是如果需要⼤规模制备病毒载体，试剂盒的质粒产量还是杯⽔车薪。此外，包装病毒通常需要三个质粒或四个质粒，每个质粒⼤⼩、序列都不⼀样，上游表达量也有区别，甚⾄稳定性都有差异。⾯对如此众多品种的质粒，⼀个能够适⽤多种质粒的、可放⼤的纯化⼯艺⽆疑会带来很⼤的便利。
接下来就向⼤家隆重介绍基于 PlasmidSelect 亲和填料的通⽤型质粒纯化⼯艺，该⼯艺可⽤于 cGMP 环境下的⼤规模质粒纯化（见图 1）。
图 1 质粒⽣产⼯艺流程图
1. ⼤肠杆菌收获——中空纤维
收集菌体⾸先想到的当然是离⼼了，但是放⼤⽆疑是离⼼机的软肋。中空纤维有开放式的通道，能够处理⾼固含量（⼤肠杆菌发酵液）、⾼粘度（菌体裂解液）和剪切⼒敏感型样品（质粒），并且具有良好的线性放⼤能⼒。在这⼀步推荐使⽤ 750KD 或 0.1、0.2um 的 1 mm 内径的中空纤维进⾏菌体的收集和清洗。
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2. 菌体裂解——碱裂解
菌体裂解⽅法有很多，常⽤的是碱裂解。不管碱裂解⼯艺怎么改，都万变不离其宗，其宗就是上古时期的⼀篇论⽂（Birnboim HC, Doly J. Nucleic Acids Res 1979;7(6):1513–23.），不再细述。
企业发展阶段3. 裂解液浓缩——中空纤维
当溶液 I、II 和 III 相继加完后，裂解液体积会变得⾮常⼤，在层析纯化前进⾏浓缩和洗滤，不仅可以⼤⼤减⼩样品体积，还可以有效去除 RNA、⾊素和部分 HCP、HCD 等杂质，减少层析阶段的负荷。对于质粒的超滤浓缩，⼀般按照如下标准（见表 1）进⾏ NWMC（GE 中空纤维）的选择，中空纤维的低剪切⼒特点可以有效保护质粒的超螺旋构象。 表 1 中空纤维的选择推荐
4. 三步层析
前⾯ blabla 说了那么多，其实层析才是本⼯艺的精华所在。三步层析⼯艺的稳健性、合理性和连贯性，均堪称教科书式的经典。第⼆步层析的 PlasmidSelect Xtra 填料凭借着强⼤的分离开环和超螺旋质粒的能⼒，占据三步层析的 C 位！其他两步层析的作⽤也不可⼩觑，三步层析功能明确、互相合作。
1
Sepharose 6FF—RNA removal
提到凝胶过滤，接受过纯化⼯艺培训的童鞋第⼀反应都会认为其不易放⼤、上样体积⼩、适合最后的精纯阶段。但是本⼯艺的凝胶过滤却扬长避短、反其道⽽⾏，⽤在了第⼀步层析。
①裂解液经过浓缩后，体积已经⼤⼤减⼩，凝胶过滤跃跃欲试未尝不可；
②⾼浓度硫酸铵的缓冲液让杂质（主要是 RNA）和质粒的空间⼤⼩的差异性达到了最⼤，质粒通过层析柱的外⽔体积⾸先流出（使⽤ 2.1 M 硫酸铵缓冲液的另⼀个精妙之处接下来再介绍）。
组分离（Group separation）模式使其上样体积达到了 0.3CV，对⽐精纯阶段凝胶过滤的 1%~5%C
V 的上样体积，的确有⾜够信⼼在第⼀步层析施展才华。本步层析以后，质粒已经达到了很⾼的纯度，琼脂糖凝胶电泳⼏乎看不到 RNA 杂带。
图 2 Step 1-Sepharose 6 Fast Flow 的实验过程和层析图谱
2
PlasmidSelect Xtra—oc pDNA removal
PlasmidSelect Xtra 填料从位于 Uppsala 的 GE 实验室开始研发到上市，⾄今已经超过 15 个年头。PlasmidSelect Xtra 强⼤的开环超螺旋分离能⼒，可能只有他的同胞兄弟 Capto PlasmidSelect 能够出马⼀战。Capto PlasmidSelect 是PlasmidSelect Xtra 的升级版，⼆者有相同的嗜硫配基，具有相同的开环超螺旋分离能⼒，只是基架不同。Capto PlasmidSelect 使⽤ Capto ImpRes 基架，较 PlasmidSelect Xtra 的 Sepharose HP 基架，可以提供更⾼的载量、流速和耐压性能。
第⼀步层析得到的质粒被置换到 2.1 M 硫酸铵的缓冲液，可以直接上样⾄ PlasmidSelect Xtra 层析柱，在此条件下，开环和超螺旋质粒均与填料结合。上样结束后，⽤ 2.0 M 硫酸铵的缓冲液冲洗层析柱时，开环质粒竟然被冲洗下来，⽽超螺旋质粒依然牢牢结合在层析柱上，直到⽤含 1.7 M 硫酸铵和 0.3 M 氯化钠的缓冲液才能将其洗脱。冲洗开环质粒和洗脱超螺旋质粒的两种缓冲液成分有很⼤的差
异，确保了本步⼯艺的稳健性。PlasmidSelect Xtra 和 Sepharose 6FF 在2.1 M 硫酸铵缓冲液的导演下⽆缝对接，在去除 RNA 和开环质粒的过程中⼀⽓呵成，不禁为开发此款填料和⼯艺的科学家点个⼤写的赞。
图 3 Step 2-PlasmidSelect Xtra 的实验过程和层析图谱
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SOURCE 30Q—Endotoxin removal
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经过前两步层析，质粒的纯度和均⼀性（超螺旋⽐例）达到了新⾼度，最后⼀步层析重点是去除内毒素。来源于⼤肠杆菌，内毒素始终是质粒的⼀个重要风险杂质。市⾯上⽆内毒质粒抽提试剂盒，其内毒素能达到的标准也只有＜100
EU/mg 质粒。
质粒带有⾼密度的负电荷，可以在⾼盐浓度下与强阴离⼦交换填料结合。将 PlasmidSelect Xtra 的洗脱液⽤⽔稀释⾄ 3倍体积，可以上样⾄ SOURCE 30Q，⽽内毒素在此⾼盐情况下不与填料结合，从⽽实现去内毒的功能。经过此步，内毒素含量可降⾄＜1 EU/mg。
Tips：如果你⼿头恰巧没有 SOURCE 30Q，也可以尝试⽤ GE 其他强阴离⼦交换填料，如 Sepharose Q
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FF，Sepharose Q HP，Capto Q 系列，Q Sepharose XL 等，但是上样条件、载量和缓冲液等条件需要重新考察。
图 4 Step 3-Source 30Q 的实验过程和层析图谱
5. 浓缩换液——中空纤维
同裂解液的超滤浓缩⼀样，推荐使⽤低剪切⼒的中空纤维，更好保护质粒的超螺旋构象。
点评
笔者见过不少质粒纯化⼯艺，但是⽐较下来，本⼯艺具有两⼤强势：
笔者见过不少质粒纯化⼯艺，但是⽐较下来，本⼯艺具有两⼤强势：
1
测针通⽤性强
亲测适⽤于3.0 kbp~30 kbp ⼤⼩的质粒（其他⼤⼩的质粒未测试过，不代表不可以）。⽆需做任何⼯艺改变就可以纯化不同的质粒，真正的通⽤型平台化⼯艺，适合⽣产病毒载体时的多质粒转染体系。
2
物理学报稳健性强
每步层析的载量均可以确定，层析条件也有较⼤的操作空间范围。裂解液中含有⼤量的RNA，其带电荷性质与质粒的类似，如⽤其他类型层析进⾏第⼀步捕获，必须要⾯对上样载量的问题。不同质粒的上游表达量、RNA 等杂质含量和发酵的批间差异等，均会对确定第⼀步层析的上样量造成⼲扰，进⽽造成⼯艺不稳定。本⼯艺的第⼀步层析使⽤凝胶过滤，上样量只与样品体积有关，⽽样品体积取决于前⼀步的超滤浓缩，简单可控。
2016年，GE⽣命科学与和元⽣物技术（上海）股份有限公司开展基因全⽅位战略合作，建设基因与细胞所需质粒和病毒载体的GMP级⽣产平台。该平台采⽤国际最先进的⼀次性⽣产技术，安全⽆污染、快速、⽣产成本低，适⽤于多种质粒和病毒产品共线⽣产。上游⼯艺采⽤悬浮培养，微载体培养和细胞⼯⼚三合⼀的平台，根据项⽬具体需要选择最佳⼯艺路线；以先进的超滤浓缩和层析纯化技术，替代传统的离⼼浓缩纯化⼯艺，显著提⾼病毒产品的纯度和⽣产收率。同时，该GMP⽣产车间还将建⽴病毒产品的质量控制体系，开发全⾯药品中控和放⾏质控检测⽅法。
和元上海可以提供如下服务产品：各种质粒载体或者基因药物、腺相关病毒Adeno-associated virus (AAV)、慢病毒Lenti virus (LV)、腺病毒Adeno virus (ADV)、痘病毒Poxvirus (PV)、逆转录病毒Retro virus (RV)、单纯疱疹病毒Herpes simplex virus (HSV)、其它溶瘤病毒Other oncolytic virus；服务种类包括：⾮注册临床研究⽤病毒⽣产、⽤于中美IND申报的临床前中试样品⽣产、⽤于临床研究的重组病毒GMP⽣产、独⽴的灌装服务和QC检测服务。
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