论著文章编号:100025404(2007)0120032204人M CHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立 袁成福，杨俊霞，魏丽丽，石 华，陈 济，宋方洲 (重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，教育部临床检验诊断学重点实验室，重庆400016)
提 要：目的 构建人MCHR2真核表达载体，转染CHO细胞，建立稳定转染的CHO细胞系。方法 采用PCR方法，以人胎脑c DNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长c DNA编码区序列，利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)，经酶切和测序鉴定后，用脂质体转染法转染CHO细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的CHO细胞系，用RT2PCR、W estern bl ot及免疫荧光法检测MCHR2的表达。结果 成功构建了pc DNA3.1(+)/MCHR2真核表达载体，并建立了稳定转染的CHO细胞系，成功地表达目的基因。结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础。 关键词:MCHR2；真核表达载体；稳定转染的CHO细胞系；基因表达
中图法分类号:R338.2;R394233;R394.3 文献标识码:A
Con structi on of eukaryoti c expressi on vector of hu man M CHR2and est ablish m en t of its stable tran sfected CHO cell li n e
Y UAN Cheng2fu,Y ANG Jun2xia,W E IL i2li,SH IHua,CHEN J i,S ONG Fang2zhou(Depart m ent of B i oche m istry and Molec2 ular B i ol ogy,ChongqingM edical University,Chongqing400016,China)
Abstract:O b j ec ti ve T o construct eukaryotic ex p ressi on vect or of human melanin2concentrating hor mone recep t or2(MCHR2)and transfect CHO cells t o establish stable CHO cell line.M e tho d s The full2length MCHR2c DNA frag ment was a mp lified by PCR fr om the human fetal brain c DNA library and was inserted int o eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+),after the identificati on by digesti on and sequencing on the recom2 binant eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2,the recombinant was transfected int o CHO cell by li pofecta m ine T M2000.After screening culture by G418,stable transfected CHO cell line was established, and the transcri p ti on and exp ressi on ofMCHR2were identified by RT2PCR,W estern bl otting and i m munofluo2 rescence.R e su lts The eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2was constructed successfully.
The stable transfected CHO cell line was established.The MCHR2p r otein was exp ressed successfully.Co nc lu2 s i o n The constructi on of the eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2and the establish ment of stable transfected CHO cell line p r ovide s olid f oundati on for further experi m ental studies on the functi on of MCHR2.
Key words:MCHR2;eukaryotic exp ressi on vect or;stable transfected CHO cell line;gene exp ressi on
肥胖是现代社会中常见的营养障碍性疾病，其发病率在发达国家和发展中国家逐年上升，已成为一个全球性的健康问题。肥胖不仅是导致心脑血管疾病、
基金项目：国家自然科学基金(30671008)
Supported by the Nati onal Natural Science Foundati on of China(30671008) 作者简介：袁成福(1976-)，男，湖北省十堰市人，硕士研究生，讲师，主要从事基因诊断与基因方面的研究，现在湖北民族学院医学院生
物化学教研室，恩施445000。电话:(023)68485991,E2mail:
m
通讯作者：宋方洲，电话:(023)68485958,E2mail:fzs m
收稿日期:2006208231；修回日期:2006210210糖尿病、高血压、高脂血症等疾病的高危因素，并且还带来许多社会问题和心理问题。多年来研究表明肥胖的发生与下丘脑对摄食的神经内分泌调控密切
相关。近年来继神经肽Y(neur opep tide Y,NPY)、刺鼠相关蛋白(agouti related p r otein,AgRP)、增食欲素(orexin, ORX)之后，又一个增强食欲的神经肽———黑素浓集激素(melanin concentrati on hor mone,MCH)进入人们的视野，随着研究的逐步深入相继发现了MCH的2个受体亚型———MCHR1和MCHR2，从而为肥胖的防治提供了新的靶点。
23第29卷第1期
2007年1月
第 三 军 医 大 学 学 报
ACT A AC ADE M I A E ME D I C I N AE M I L I T AR I S TERTI A E
Vol.29,No.1
Jan.2007
第1期 袁成福，等.人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立
本实验将人MCHR2基因的全长c DNA克隆到pc DNA3.1(+)质粒的C MV启动子的下游，从而获得了
一个能在真核细胞中组成性表达人MCHR2蛋白的pc DNA3.1(+)/MCHR2表达载体。将该载体转染CHO细胞并筛选组成性高表达人MCHR2的细胞系，从而建立了一个MCHR2基因高表达的CHO细胞模型，为mcHR2基因的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
人胎脑c DNA文库购自Cl ontech公司。菌株E.coli DH5α，质粒pc DNA3.1(+)和CHO细胞由本教研室保存。RT2PCR试剂盒购自T oyobo公司;Taq DNA多聚酶,T
4
DNA连接酶，限制性内切酶(Eco RⅠ,XhoⅠ)等工具酶均购于TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Q iagen公司；脂质体L i po2 fectam ine T M2000为I nvitr ogen公司产品;G418购自Am resco公司；总RNA抽提液Tri pure购自Roche公司;MCHR2的抗体购自Santa Cruz公司,HRP标记的兔抗羊I gG和F I TC标记的兔抗羊I gG购自北京鼎国公司。昭陵被盗
江阴城南小学1.2 技术路线与方法
1.2.1 引物设计 上游引物:5′2CCGG AATTCACC AT2
G AATCCATTTCATGC ATCTTG23′；下游引物:5′2CCG CTCG AG2 CT AAAAGTGTG ATTTC AG AGTGT23′。其中分别在上游和下游引物的5′端加上了Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点和3个保护碱基(CCG)，并且在起始密码前添加了Kozak序列(ACC)，引物由TaKaRa公司合成。
1.2.2 人MCHR2c DNA的扩增 以人胎脑c DNA文库为模板，采用PCR的方式扩增人MCHR2c DNA的编码区，全长为1023bp。PCR50μl反应体系中加入c DNA模板2μl,10×PCR缓冲5μl,MgCl23μl,d NTP(2.5mmol/L)4μl，上下游引
物(20μmol/L)各1μl,Taq DNA多聚酶0.5μl,H
2
O补足至50μl，反应条件为:94℃预变性5m in;94℃60s→57℃退火40s→72℃延伸70s(35个循环);72℃继续延伸10m in。电泳初步鉴定PCR产物。
1.2.3 人MCHR2真核表达载体的构建 将上述PCR产物和pc DNA3.1(+)质粒分别用限制性内切酶Eco RⅠ和XhoⅠ双
酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T
4
DNA连接酶过夜连接后转化E.coli DH5α感受态，氨苄青霉素筛选培养，挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行酶切和DNA测序鉴定。1.2.4 建立稳定转染人MCHR2的CHO细胞系 CHO细胞在含10%小牛血清的DM E M/F212培养基中，于37℃、5% CO2的饱和湿度下培养。待细胞融合至70%～80%时按照L i2 pofecta m ine T M2000操作说明书进行空质粒pc DNA3.1(+)和重组表达载体pcDNA3.1(+)/MCHR2的转染。转染48h后，用胰蛋白酶消化细胞，在含有G418(900μg/m l)的选择性培养基中加压筛选6周，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，扩增培养即为稳定表达人MCHR2的CHO细胞系，命名为CHO2 MCHR2细胞。1.2.5 指标检测
1.2.5.1 RT2PCR检测MCHR2转录水平的表达 收集CHO空质粒转染细胞以及CHO2MCHR2转染细胞，按Trizol试
剂说明书抽提细胞总RNA，取1μg进行反转录。反转录20μl 体系中加入总RNA2μl，随机引物1μl,5×RT缓冲液4μl, d NTP(10mmol/L)2μl,RNAase抑制剂(10U/μl)1μl,MMLV 逆转录酶1μl,H
2
O补足至20μl，混匀,30℃10m in,42℃20m in,99℃5m in终止反应。以G AP DH(450bp)为内参进行PCR反应。在25μl反应体系中加入c DNA模板5μl,10×PCR
缓冲液2.5μl,MgCl
2
1.5μl,d NTP(
2.5mmol/L)1.0μl，上下
游引物(20μmol/L)各0.5μl,Taq DNA多聚酶0.25μl,H
2
O 补足至25μl，反应条件为:94℃预变性5m in;94℃60s;56℃退火50s;72℃延伸70s,30个循环;72℃继续延伸7m in。取等体积RT2PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并照像。
1.2.5.2 W estern bl ot检测MCHR2翻译水平的表达 收集转染细胞，裂解后取20μg处理后的蛋白样品进行S DS2P AGE 电泳并电转移至P VDF膜上,5%脱脂奶粉室温振荡封闭1h，与1∶200稀释后的一抗4℃孵育过夜,P BST洗膜3次，每次10m in，然后与1∶5000稀释后的HRP标记的二抗室温孵育2h,P BST洗膜3次，每次10m in,DAB显，检测目的蛋白。1.2.5.3 免疫荧光检查 将转然pc DNA3.1(+)/MCHR2的CHO2MCHR2细胞以1×105密度种植在6孔板中，同时用未转染pc DNA3.1(+)/MCHR2的CHO细胞作对照,24h细胞贴壁后用P BS缓冲液冲洗3次。以新鲜配制的4%多聚甲醛固定细胞30m in,5%兔血清封闭1h,P BS缓冲液冲洗后，山羊抗人MCHR2为一抗(4μg/m l),4℃湿
盒中孵育过夜,P BS缓冲液冲洗后用F I TC标记的兔抗山羊I gG二抗(4μg/m l)闭光孵育2h，封片后用激光扫描共聚焦显微镜观察MCHR2在细胞内的表达情况。
2 结果
2.1 真核表达载体pc DNA
3.1(+)/MCHR2的鉴定
pc DNA3.1(+)/MCHR2质粒的酶切鉴定结果见图1、2。pc DNA3.1(+)/MCHR2重组质粒经H incⅡ单酶切后理论上可切出234、1472、2185、2536bp大小的4个片断，在图1中1泳道pcDNA3.1(+)/MCHR2重组质粒经H incⅡ单酶切后在1000bp及2000bp之间有一条带，其大小约1472bp，在2000bp及3000bp之间有2条条带，其大小约2185bp及2536bp，与理论相符。pc DNA3.1(+)/MCHR2重组质粒经限制性内切酶Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切后见约1023bp大小的清晰条带，与MCHR2基因大小相符。见图2中1泳道所示,2泳道为Eco RⅠ单酶切，线性化的质粒与预期大小相符,3泳道为未酶切质粒。以pc DNA3.1(+)质粒载体多克隆位点上的通用引物(P BGFP和BGH方向)进行双向测序鉴定，结果表明pc D2 NA311(+)/MCHR2重组质粒插入片段的序列与Gene Bank中AY562946报道的MCHR2cDNA序列完全一致，表明人MCHR2的真核表达载体构建成功。将其命名为pc DNA3.1(+)/ MCHR2。
33
1:pc DNA3.1(+)/MCHR2重组质粒经H inc Ⅱ单酶切;M：标准1kb DNA Ladder
图1 pc D NA3.1(+)/M CHR2质粒的H inc Ⅱ
单酶切鉴定电泳图
M：标准Ⅳ;1:Eco R Ⅰ和X ho Ⅰ双酶切;2:Eco R Ⅰ单酶切;3：未酶切
农具模型图2 pc D NA3.1(+)/M CHR2质粒的酶切鉴定电泳图
2.2 指标检测
2.2.1 CHO 细胞克隆中MCHR2mRNA 的表达 结果表明
稳定转染pc DNA3.1(+)/MCHR2的细胞所提RNA 能扩增出代表MCHR2基因(1023bp )及内参G AP DH 基因(450bp )的条带，而稳定转染pc DNA3.1(+)空质粒的细胞所提RNA 仅能扩增出代表内参G AP DH 基因的450bp 条带，说明MCHR2基因在稳定转染pcDNA3.1(+)/MCHR2的CHO 细胞中mRNA 水平上得到了表达。
2.2.2 CHO 细胞克隆中MCHR2蛋白的表达 W estern bl ot
网络文学的价值检测结果如图3所示，稳定转染pcDNA3.1(+)/MCHR2的细胞检测到MCHR2在蛋白水平的表达，而对照的空质粒转染后的细胞则没有相应的条带，表明所构建的真核表达载体已在真核细胞CHO 内表达
。
1：转染pc DNA3.1(+)的细胞;2：转染pc DNA3.1(+)/MCHR2的细胞
图3 M CHR2基因蛋白水平的W estern blot 分析结果
2.2.3 免疫荧光检测 在稳定转染pc DNA
3.1(+)/MCHR2的CHO 2MCHR2细胞中可以清楚看到荧光表达(图4A )，而对照的未转染CHO 细胞则没有相应的荧光表达(图4C ),CHO 细胞形态清晰可见。表明所构建的真核表达载体已
在真核细胞CHO 内表达
。
A：荧光检测转染pc DNA3.1(+)/MCHR2的CHO 2MCHR2细胞;
B：只用透射光检测转染pc DNA3.1(+)/MCHR2的CHO 2MCHR2
细胞;C：荧光检测未转染pc DNA3.1(+)/MCHR2的CHO 对照细胞;D：只用透射光检测未转染pc DNA3.1(+)/MCHR2的CHO 对照细胞
图4 CH O 细胞的免疫荧光检查结果 (×400)
3 讨论
黑素浓集激素(MCH )是19个氨基酸的环状肽，最先于硬骨鱼中发现，它的激活可导致黑素沉着，因此得名。MCH 与许多生理功能有关，如感觉、应激反应和学习，但其主要在摄取食物及能量平衡方面
发挥重要作用[1]
，多个动物实验证实MCH 是一种能够增加食欲的神经肽，在调节能量平衡中起重要作用。直接在脑室内、室旁核等急性注射MCH 能引起食物
摄入短暂增加[2]
；脑室内慢性注射MCH 会刺激大鼠
;Lud 2
wig 等[4]茱莉亚 罗伯兹
制造了过度表达MCH 的转基因小鼠，发现小鼠摄食过多，具有高脂蛋白血症，高血糖和胰岛素抵抗特点。敲除小鼠MCH 基因，可导致消瘦综合征(表现为小鼠摄食减少，代谢增加，体质量减轻)。由此可见MCH 在调节体质量中起关键性作用。
对MCH 受体(melanin 2concentrating hor mone re 2cep t or,MCHR )的研究起步较晚，直到1999年才到第1个人MCH 受体(MCHR1)，即与生长抑素受体的
43 第 三 军 医 大 学 学 报 第29卷
第1期 袁成福，等.人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立
跨膜区40%氨基酸序列同源的孤儿G蛋白偶联受体S LC21[5]，其基因定位于染体22q13.3，其编码区没有内含子,c DNA全长1269bp，最终的蛋白产物含353个氨基酸。Marsh等[6]研究小组应用基因敲出技术研究了MCHR1的功能，发现MCHR1敲出小鼠体质量正常，体形瘦，脂肪含量低，血浆瘦素、胰岛素水平低于对照，并且进食高脂饮食不易诱发肥胖，提示MCHR1的功能可能是MCH调节能量平衡的中介，而MCHR1失活则有望减轻高脂饮食所诱导的肥胖。现人们已研制出MCHR1的拮抗剂以期望肥胖症[7]。2001年Sailer等[8]发现MCH的第2个受体亚型(MCHR2，又名GPCR145)。该受体基因定位于染体6q16.226q21，有5个可编码的外显子,c DNA全长1023 bp，编码具有340个氨基酸的蛋白质。MCHR1和MCHR2均属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族。
通过定量RT2PCR、Northern杂交及原位杂交技术证实,MCHR2主要在大脑表达，尤其在下丘脑前部和外侧区以及腹内侧核区表达丰度高，表明MCHR2可能参与进食行为的调控。此外，据报道肥胖患者在第6号染体长臂发生细胞遗传学改变，而MCHR2正好定位于染体6q，也提示MCHR2可能与肥胖的发生相关。肥胖是胰岛素抵抗与2型糖尿病的主要危险因子。为研究MCHR与糖尿病的关系,B jursell等[9]在瘦素(lep tin)缺乏的小鼠中敲除MCHR1基因发现小鼠能增加胰岛素的敏感性，说明MCHR1在调节胰岛素敏感性中有重要作用。这一点与Pereira2da2Silva 等[10]报道一致。同时在上述小鼠中敲除MCHR1基因能增加小鼠活动率，小鼠消瘦和脂肪量减少；而涉及非饱和脂肪生物合成的硬脂酰CoA去饱和酶21(SCD2 1)的mRNA却表达上调(这一点与MCH敲除小鼠能降低SCD21基因表达
相反)，表明敲除MCHR1的小鼠减少脂肪量，并非脂肪合成减少，可能与增加活动率有关。MCHR1敲除小鼠能增加心率及体温，表明MCHR1能影响自主神经系统。研究表明在褐脂肪组织中MCHR1敲除小鼠的生热作用依赖于线粒体内膜的解偶联蛋白21(UCP21)的解偶联作用。但MCHR2与糖尿病的关系包括它与胰岛素敏感性、SCD21、UCP21的关系仍不清楚，因此需要对MCHR2基因功能及与肥胖和糖尿病等的关系作进一步的研究，而获得MCHR2基因高表达的细胞克隆则是进行上述研究的基础。
本研究以人胎脑c DNA文库为模板获得MCHR2基因c DNA编码区，并插入到pc DNA3.1(+)载体的C MV启动子下面，从而成功构建了一个组成性表达人MCHR2蛋白的表达载体pc DNA3.1(+)/MCHR2。将该载体转染到CHO细胞，通过G418筛选和基因组DNA的PCR分析等方法成功地建立了一个在基因组DNA中稳定整合有pc DNA3.1(+)/MCHR2的CHO 细胞克隆，将该细胞克隆的细胞扩增，然后提取总RNA和蛋白，并利用RT2PCR、W estern bl otting和免疫荧光法检测到MCHR2基因在mRNA和蛋白水平均有表达。综上所述，我们认为本研究成功地建立了一个在基因组DNA中稳定整合有pc DNA3.1(+)/MCHR2载体的CHO细胞系，在该细胞系中MCHR2基因得到了表达。它的建立为MCHR2基因的功能研究提供了一个细胞模型，关于MCHR2功能特性及它与肥胖的关系的研究，我们将作进一步研究。
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(编辑 栾 嘉)
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