西安航天动力机械厂
作为一种基因转导办法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射办法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞内。与其他常用的导入外源物质的办法相比，电穿孔具有无数优点。首先，不必像显微镜那样用法玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞举行注射。其次，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，由于电穿孔是一种物理办法，较少依靠细胞类型，因而应用广泛。事实上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学办法高得多。 试验原理 当细胞置于十分高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子蔓延进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、 RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞内。 材料（试剂及设备） (1) 缓冲液与溶液PBS缓冲液（配方参考《分子克隆试验指南》）。 (2）核酸与寡核苷酸质粒DNA：转染前将所要转的质粒在细胞室内无菌沉淀（1/10体积的3moUL NaAC, 2倍体积的无水乙醇），在超净台中用70％的乙醇（无水乙醇与灭菌水在无菌状态下配制）清洗2次，晾干，加灭菌水溶解。用0. 1×TE（pH 7.6)溶解DNA至终浓度25 μg/ml，每毫升培养基需要50μl质粒溶液。 (3）培养基：为彻低培养基。 (4）其他设备电穿孔仪、细胞培养用培养箱（(37℃, 5% CO2 的加湿培养箱）、超净台、冰箱、离心机、Vortex振荡器（选用）、1. 5mlEP管、移液器及tip头、试管架、计时器和60mm组织培养皿或12孔板。 (5）细胞：指数生长的哺乳动物细胞培养物。细胞预备：转染前一到两天将细胞传代至平皿中（视目的不同所用平皿规格不同），使细胞密度在做转染时达到所需密度（详细细胞密度视细胞生长速度而定，标准是在收细胞时细胞密度达到100%）。 转染办法 (1）贴壁细胞用胰酶消化后离心（室温，1000r/min, 3min）收集细胞，悬浮细胞挺直离心收集细胞。 (2）用无菌PBS重新悬浮细胞，离心（室温，1000r/min, 3min)收集细胞。 (3) 用0. 5 ml无菌PBS重新悬浮细胞，将细胞悬浮液转移至无菌电穿孔小杯中。 (4）加入适量的质粒DNA溶液（DNA溶液浓度1-40μg/ml) ,混匀。 (5）将小杯置于电穿孔仪中，在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度，启动装置，供应所需的电脉冲。 (6) 将电脉冲处理过的细胞转移至细胞培养容器（培养皿或培养孔）中，再加入一些彻低培养基，将样品细胞放回孵育箱中使之在正常条件下生长。【关键词】电穿孔 质粒 DNA转染 上一篇： 下一篇：
>抗弯强度>bdm>秩和检验
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议