1、LB液体培养基
（1）配方：
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
（2）配制：
A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。
C、定容。
D、加塞、包扎。
F、高压灭菌121℃，30min，灭菌后室温保存备用。若要分装需要在超净台内。 G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP）。先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。（可以多配制一些，分装为1ml/管）
2、LB固体培养基
（1）配方：
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 5g/L
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
氨苄青霉素溶液 100µg/ml（终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基）
琼脂粉 15g/L
（2）配制：
A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。
稻壳灰C、5mol/L NaOH溶液调pH到7.4。
D、定容。
E、分装、加塞、包扎。
F、高压灭菌121℃，30min。
G、灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中（或室温），待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。
（3）倒板：
一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封
口，4℃保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。
首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌 摇菌器申请，张评浒老师，王雪师；
注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP；蓝黄白头至少个一盒，备用；1.5ml doff管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液，则先灭菌5ml头）；超纯水和TE buffer
Step1：转化:
事前准备的：
提前将固体培养基至于超净台中，使之回复室温；
灭过菌的L形玻棒，确认微生物室有灭过菌的；
灭过菌烘干的进口1.5ml doff管足量；
100μL及灭菌黄头（微生物室或许有），10μL及灭菌白头；
Marker笔
烧杯，温度计
小冰盒以及冰
富露施注意感受态融化需要时间，可以先将感受态取出融化的时间内做其他准备工作
感受态提前半小时从-80冰箱取出插到冰里融化，半融化即可（冰内30min即可）。
将冰箱里的固体培养基，灭过菌烘干的进口1.5ml doff管，灭过菌的L形玻棒，及头取出备用。
感受态融化后将其分装，50µl/管（注意在加质粒前在各个管子上标注好要加入的质粒名称
以防混淆）。
每个管加3µl质粒，轻轻吹打均匀，冰上静置30min 。
42℃水浴放置90秒后迅速拿出，插到冰里。
铺板，每个质粒铺5µl/板。放置过夜。
所有操作尽量在超净台内完成，避免杂菌污染。
Step2：小摇及大摇
事先准备：莫迪利亚尼
灭过菌的加过AMP的LB液体培养基，每个质粒至少250ml左右；
无限自我15ml离心管；
灭过菌的250ml及500ml或1000ml锥形瓶
灭过菌的白头及；灭过菌的蓝头及；
marker笔，医用胶带，封口膜，垃圾袋
灭过菌的锡箔纸
申请Beckman离心机，借Beckman离心机专用离心管，为第二天抽提做准备
1、观察菌落生长状况，若无异常，准备小摇。
2、准备LB液体培养基（灭菌，AMP），分装至50ml离心管中（注明使用与否、加氨苄量、配制时间等），可在4度冰箱内储备使用；将15ml离心管上按待扩增质粒名称做好标记。
3、从分装的50ml离心管中，向15ml离心管中加入2ml液体LB（灭菌，AMP）培养基（注意尽量不要留在瓶壁上）。多余培养基使用后封口，4度保存。
4、以孤立的菌落点为目标，用头（推荐白头）刮取微量菌落，溶于2ml培养基中。将离心管盖子拧松后用胶带固定
5、小摇，时间以具体情况定。一般从上午10点左右开始小摇，到当天下午5点可以准备大
摇。
6、封好固体培养基，放回4度冰箱，收拾好微生物室台面，清理废液缸及垃圾桶（为了以后能顺利申请到）
7、小摇成功后，液体LB（灭菌，AMP）培养基，每250ml分装于500ml或1000ml锥形瓶中（瓶越大，培养基震荡越充分），不需严格定量。将小摇完成的培养基加入大锥形瓶中（注意在瓶上做好相关标记），灭菌过的锡箔纸包裹瓶口，大摇，过夜。
Step3：质粒抽提（大提，若为中提或小提具体看说明书）（使用进口器材）
注意及时申请Beckman离心机，除了20000g转速必需，其余6000g转速可以用张评浒老师德尔Sigema离心机代替；
准备好试剂盒，检查试剂盒中各个试剂是否足够，每个质粒Buffer P1（4度预冷）10ml，Buffer P210ml，BufferP3（4度预冷）10ml，Buffer QBT 10ml，BufferQC 60ml，Buffer QF15ml。
准备足量50ml离心管，每个质粒至少需要7个离心管；
准备足量的灭菌doff管
灭过菌的移液管及电动移液器（若无，可用1000微升及灭过菌的蓝头代替）
冰及冰盒
1000微升及灭过菌的蓝头
灭过菌的超纯水，无水乙醇，未灭菌的TE buffer以及灭过菌的TE buffer（细胞房冰箱有，若无可用滤器制备一些），异丙醇，3M乙酸钠
1、将大摇完成的瓶子中的培养基分装到5个50ml离心管中，此时培养基浑浊。
2、Beckman离心机，Beckman离心管，6000g、4℃、15min。（提前一天申请离心机的使用），需分批离心。离心后尽快，小心地弃上清。
3、加入4℃预冷的Buffer P1 10ml，重悬大肠杆菌。由于菌分装在若干离心管中，先将10ml加入一个离心管中，吹起沉淀的菌，吹匀，加到另一个离心管里，再吹，依次将菌全部收集到Beckman离心管。
4、加入Buffer P2 10ml，翻转混匀4-6次，室温（15-25℃）孵育5min。
5、加入4℃预冷的Buffer P3 10ml，翻转混匀4-6次，冰上孵育20min。
6、离心，使裂解的大肠杆菌沉淀，20000g、4℃、30min。
7、将上清转移到50ml离心管中，二次离心，6000g、4℃、30min。
8、安装QIAGEN-tip。
床垫是越硬越好吗*
9、向tip中加入10ml Buffer QBT，随重力流下，以平衡tip。
10、小心加入第7步得到的上清，注意不能让沉淀漂起，否则要再离心。随重力流下。质粒将留在树胶滤器中。
11、向tip中加入2×30ml Buffer QC，随重力流下
12、将15ml 65℃预热的Buffer QF加入tip，于tip下安置50ml离心管，接滤出的液体，含质粒。
13、向含质粒的滤出液中加入10.5ml，即0.7倍QF体积的异丙醇，以使DNA沉淀。加入后6000g、4℃、1h。小心地弃去上清（注意离心之后立即倒净异丙醇，否则沉淀将漂起）。
14、向50ml离心管加入400µl未灭菌的TE buffer，吹起，溶解，转移至1.5ml 进口灭菌doff管。室温静置30min。
15、向doff管中加60µl乙酸钠和650µl无水乙醇，出现沉淀。10000rpm，4-8℃，10min。（离心机预冷）
16、尽可能的吸去上清。加入75%乙醇1ml（已灭菌分装的超纯水250µl+无水乙醇750µl，混合于灭菌的进口doff管，注意应当先在另一个灭菌doff管中配好，绝不可先向沉淀里加水，否则即便加了酒精，沉淀也很难析出），10000rpm，4-8℃，5min。尽可能吸去上清乙醇，然后重复以上离心，尽可能吸去上清乙醇。最后放置超净台中风干（最大风量约15-20min）。
17、加150µl灭过菌的细胞房存放的TE buffer，溶解后封口膜封口，-4℃保存1-2天，待其完全溶解后测定吸光度。测定吸光度后-20℃保存。具体要求何种浓度为提取成功，依据后续细胞转染实验要求而定（参考值为1μg/ml）
Step4 浓度测定
1、准备比皿，PCR用2.5µl、100µl及相应灭过菌的进口头，面巾纸，新鲜的超纯水。（注意防护，戴口罩，最好用酒精擦拭附近桌面，老师建议可以在超净台内吸取所需质粒提取液，取出来测）
2、打开仪器，选择“DNA”，“Dilution”保持为“100”。若浓度较低，测不出浓度，则换稀释
比例“Set up”→“enter”，选择“Dilution”→直接输入50 电子政务信息平台→“enter”，操作依旧，先调零，后测定，但是98μL水+2μL样品。其他稀释度如此。
3、洗净比皿，反复洗三次，挥干水分。加入99µl水。放入仪器，“Ref”调零。
4、调零后，加入1µl样品，放入仪器，按“DNA”or“Enter”
5、记录浓度，280/260、260/230。260/280最好在1.9-2.0之间，而260/230最好在2.0以上
豫公网安备41160202000603
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