⾃噬简介
⾃噬（autophagy=self-eating）意为⾃体吞噬，是真核细胞在⾃噬相关基因（autophagy related gene，Atg）的调控下利⽤溶酶体降解⾃⾝细胞质蛋⽩和受损细胞器的过程。⾃噬可防⽌细胞损伤，促进细胞在营养缺乏的情况下存活，并对细胞毒性刺激作出反应。⾃噬包括⽣理条件下的基础型⾃噬和应激条件下的诱导型⾃噬。前者是细胞的⾃我保护机制，有益于细胞的⽣长发育，保护细胞防⽌代谢应激和氧化损伤，对维持细胞内稳态以及细胞产物的合成、降解和循环再利⽤具有重要作⽤；但⾃噬过度可能导致代谢应激、降解细胞成分，甚⾄引起细胞死亡等。研究表明，⾃噬能在细胞稳态、衰⽼、免疫、肿瘤发⽣及神经退⾏性疾病等多种⽣理病理过程中发挥重要作⽤。 晁秀花
根据包裹物质及运送⽅式的不同可将⾃噬分为3种类型：
①巨⾃噬（macroautophagy）：通过形成具有双层膜结构的⾃噬体（autophagosome）包裹胞内物质，最终⾃噬体与溶酶体融合。⼀般情况下所说的⾃噬是指巨⾃噬。 ②微⾃噬（microautophagy）：通过溶酶体或液泡表⾯的形变直接吞没特定的细胞器。
③分⼦伴侣介导的⾃噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）：具有KEFRQ样基序的蛋⽩在HSP70
伴侣的帮助下，通过LAMP-2A转运体转运到溶酶体。
图1. 3种⾃噬途径(Duraes Fernanda V et al. Front Immunol, 2015)
⾃噬的发⽣过程
⾃噬的本质其实是细胞内的膜重排，其发⽣过程⼤体分为以下4个阶段：⾃噬的起始→隔离膜和⾃噬体的形成→⾃噬体与溶酶体融合→⾃噬体的裂解（图2）。
图2. ⾃噬的发⽣过程（Li et al. Molecular Cancer, 2020）
⾃噬相关蛋⽩
在⾃噬的发⽣过程中，有多种⾃噬相关蛋⽩可调节和控制⾃噬形成的不同阶段。迄今为⽌，科学家已在酵母中鉴定出40
在⾃噬的发⽣过程中，有多种⾃噬相关蛋⽩可调节和控制⾃噬形成的不同阶段。迄今为⽌，科学家已在酵母中鉴定出40余个编码ATG蛋⽩的基因，并且⼤多数在酵母和哺乳动物之间⾼度保守。在哺乳动物细胞中，饥饿诱导的⾃噬⼤约受20种核⼼ATG基因调节，它们在液泡附近被不断募集，并组装形成⾃噬前体。这些基因的分类和作⽤（图3）如下：
图3. ⾃噬相关基因及其在⾃噬中的蛋⽩质功能（Li et al. Molecular Cancer, 2020）
⾃噬的调控
细胞基础⽔平的⾃噬活性很低，不适于观察，因此，对⾃噬研究多需⼈⼯⼲预。⽬前常⽤的⾃噬激动剂有Rapamycin和EBSS等，常⽤的⾃噬抑制剂有Chloroquine、3-MA、NH4Cl和 Bafilomycin A1等。这些⾃噬激动剂和抑制剂可以分别激活/抑制⾃噬发⽣的不同阶段，可以根据实验需要选择合适的激动剂或抑制剂。更多⾃噬调控药物见图4。
图4. ⾃噬通路调控药物（Lorenzo Galluzi et al. 2017）
⾃噬的检测⽅法
在⽣理条件下，细胞⾃噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下会显著上调。另外，⾃噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退⾏性疾病等。选择理想的检测⽅法对于⾃噬研究⾄关重要。常⽤的观察和检测⽅法有∶
1、透射电镜法
⾃噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察⾃噬不同阶段的形态变化是⼀种⾮常直接的⽅法。
ertl表1. ⾃噬各阶段的形态学特征
干旱区资源与环境图5. ⾃噬⼩体和⾃噬溶酶体形态（Noboru, Mizushima et al. Cell, 2010）安里屋
LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个⾃噬过程，是⽬前公认的⾃噬标记物。哺乳动物的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B应⽤⼴泛。
LC3蛋⽩合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露⽢氨酸残基，产⽣胞浆定位的LC3-I。在⾃噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加⼯，与磷脂酰⼄醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于⾃噬体内外膜上。⾃噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产⽣LC3-I循环利⽤；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致⾃噬溶酶体中LC3含量很低（图6）。因此，可以通过荧光
显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，实现对⾃噬发⽣的检测。
图6. LC3在⾃噬发⽣中的路径
(Kiriyama Y et al. International Electronic Conference on Medicinal Chemistry, 2016)
GFP-LC3单荧光和mCherry-GFP-LC3双荧光指⽰系统
⾃噬形成时，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋⽩转移⾄⾃噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿⾊或黄⾊荧光斑点。当⾃噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，⽽mCherry荧光不受影响，⾃噬溶酶体呈现红⾊荧光（图7）。因此，可以通过LC3荧光指⽰系统来监测⾃噬流。
图7. LC3⾃噬双标系统追踪⾃噬流不同阶段
（Hansen T E, Johansen T. BMC Biology, 2011）
3、Western Blot检测LC3和p62蛋⽩的表达量
①利⽤Western Blot检测LC3-II/I⽐值的变化评价⾃噬形成（图8）。⾃噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉⼀⼩段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。因此可以通过LC3-II/I⽐值的⼤⼩估计⾃噬⽔平的⾼低。
图8. WB检测⾃噬通量⽰意图汽车使命
（Yoshii, S.R. and N. Mizushima. Int J Mol Sci, 2017）
②除LC3外，其他⾃噬底物表达量的变化也可以⽤于监测⾃噬流。其中，p62是研究⼴泛的⼀个⾃噬底物。在⾃噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋⽩之间的桥梁，被选择性地包裹进⾃噬体，之后被⾃噬溶酶体中的蛋⽩⽔解酶将其降解（图9），所以p62蛋⽩的表达量与⾃噬活性呈现负相关。因此，利⽤Western Blot检测p62蛋⽩的表达量也可以评价⾃噬⽔平。
图9. p62介导的选择性⾃噬模型（Ichimura Y et al. J Biol Chem, 2008）
4、基于Keima蛋⽩的⾃噬评价
Keima是⼀种pH敏感型荧光蛋⽩，利⽤它在中性和酸性pH中荧光信号不同的特性，可以直观地反映⾃噬程度。将细胞质的Keima传递到溶酶体可反映⾮选择性⾃噬，将Keima融合到特定的蛋⽩(如融合到线粒体靶向序列—mt-Keima)可⽤于反映选择性⾃噬。值得注意是，基于keima的检测不能在固定细胞中进⾏，因为这种检测完全依赖于溶酶体的酸性。
图10. 基于Keima蛋⽩的⾃噬评价
测井解释（Yoshii, S.R. and N. Mizushima. Int J Mol Sci, 2017）
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