PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增
现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
原因：
1.引物特异性差
2.模板或引物浓度过高
3.酶量过多
4.Mg2+浓度偏高
5.退火温度偏低
6.循环次数过多
对策：
1.重新设计引物或者使用巢式PCR
2.适当降低模板或引物浓度
3.适当减少酶量
4.降低镁离子浓度
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.减少循环次数
问题3：拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：
1.模板不纯
2.Buffer不合适
3.退火温度偏低
4.酶量过多
5.dNTP、Mg 2+浓度偏高
6.循环次数过多
对策：
1.纯化模板
2.更换Buffer
3.适当提高退火温度
4.适量用酶
5.适当降低dNTP和镁离子的浓度
6.减少循环次数
问题4：假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原因： 靶序列或扩增产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR引物设计的黄金法则 （转自tiangen） 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区 养路工人之歌2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38制砂，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm戴力扬值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与C
ross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子
序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序
列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：
1)避免重复碱基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
7)南极条约引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显
子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
PCR操作规程
PCR与定量PCR反应最大的魅力是扩增能力与高灵敏度，但易污染一直是困扰各实验室的大问题，极微量的污染就可能造成假阳性反应，破坏实验结果。如何监测与防止PCR污染，是现在各实验室的重要课题。
一、污染监测
一个好的PCR实验室，必须要时刻注意污染的监测，考虑是否受到污染，如有污染，是何原因造成的。通过有效地监测，采取正确的相应措施，防止或消除污染。
对照实验是监测PCR污染的重要手段。
1. 阴性对照：阴性对照是每次PCR实验都必须做的。它包括了标本对照与试剂对照，通过对照确认样本和试剂是否受到感染。
2. 阳性对照：它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好、经鉴定是该产物的标本。但阳性对照其对检测或扩增样品污染 的可能性很大。因而当某一PCR试剂已经使用稳定，检验人员完全掌握时，在之后的实验中应尽可能免设阳性对照。来减小污染概率。
3. 选择不同区域的引物进行PCR扩增。
4. 重复性试验。
二、防止污染的方法
1. 合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增以及PCR产物的鉴
定等步骤进行分区或者分室，尤其要将样本处理和PCR产物的鉴定与其它步骤严格分开。理想的分区为，标本处理区、PCR 反应液制备区、PCR循环扩增区、PCR产物鉴定区。
Real-time PCR实验攻略
实验中必须坚持的一些好习惯
1. 加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。
2. 移液用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。
3. 所有的试剂都自己配，出了问题才好原因一. 防止RNA酶污染的措施。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180 ℃的高温下干烤6 h或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10 min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37 ℃处理12 h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22 μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩. 帽子. 手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类. 动物. 植物. 微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生
物材料急速冷冻后，储存于-80 ℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入1 ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1 ml Trizol后，反复用吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30 ℃下放置5分钟；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 在室温下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分钟后，12 000 g（2 ℃～8 ℃）离心15分钟； 3. 取上层水相（离心后，混合物将分离为底层为浅红的. 中层为酚-氯仿相. 上层为无的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15 ℃～30 ℃）放置10分钟，12 000 g（2 ℃～8 ℃）离心10分钟。【如果希望分离DNA或蛋白质，保留中层和下层酚-氯仿相，有机相能保存在4°C一夜】
4. 弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1 ml Trizol
液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混匀，4 ℃下7 500 g离心5分钟【RNA能够在-20 °C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】
5. 小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会使RNA失去溶解性，导致A260/280 ratio <1.6。
6. 加适量Rnase-free water 溶解RNA沉淀，用头反复吸取混匀，55-60 ℃水浴10-15 min。进行下游实验或-70 ℃保存备用。
7. RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
预计的总RNA产量：
[注意]
1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值 2. 加氯仿前的匀浆液可在-70 ℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。
总mRNA的提取(自己的经验)
一、关于Trizol Reagent需要的试剂
1. Chloroform：氯仿 (分析纯)
2. Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)
3. 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4. RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500 ml（50 ul），在37 ℃过夜，并高压灭菌即得（150 ℃ 3小时）
5. 一次性塑料手套
6. 注意：DEPC有致癌之嫌
7. 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50 ul，取10 ul加无Rnase水990 ul，稀释100倍成1 ml。
于0.5 cm厚的石英比杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio <1.6。
8. 分离组织10 mg（纯组织）加800 ul Trizol试剂。
二、DEPC处理方法如下
1. DEPC处理
温州号导弹护卫舰（1）DEPC水：100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2） Tip头(头）. EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT 我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。
药酒炮制
4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。 最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，头盒插好头后，加入1-2 ml的0.1%DEPC水，再灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的头买，直接用不用处理的。
实时荧光定量PCR技术原理与应用
聚合酶 链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸 片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。
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