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《中国癌症杂志》2021年第31卷第4期
CHINA ONCOLOGY 2021 Vol.31 No.4基金项目：福建省教育厅中青年教师教育科研项目（JAT170712）；福建省大学生创新训练项目（201812631006）； 厦门医学院呼吸疾病研究所课题（HXJB-03）。通信作者：王玉孝 E-mail: 1010531340@qq
蛋白激酶CβⅡ通过IL-6自分泌途径促进肝细
刘 敏1,2，陈添亮3，郭 娟4，伊 雪1,2，高洪泉1，巫佳翠1，王玉孝1
1.厦门医学院基础医学部，福建 厦门 361023；
2.机能与临床转化福建省高等学校重点实验室，福建 厦门 361023；
3.厦门医学院临床医学系，福建 厦门 361023；
4.厦门医学院附属第二医院病理科，福建 厦门 361023
［摘要］ 背景与目的：肿瘤微环境中存在的炎性因子参与肿瘤的生长及转移，蛋白激酶CβⅡ（protein kinase CβⅡ，PKCβⅡ）能否通过调节炎性因子参与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）的侵袭尚不清楚。研究PKCβⅡ对HCC 侵袭的作用及相关机制，深入探讨PKCβⅡ与肿瘤炎性微环境之间的关系。方法：收集PKCβⅡ高表达细胞的条件培养基处理HCC 细胞，采用transwell 法检测细胞的侵袭情况，采用细胞因子抗体芯片检测上清液中细胞因子的变化，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA ）和实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluoresc ence quantitative polymerase chain reaction ，RTFQ-PCR ）检测PKCβⅡ高表达对白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）上清液中含量及转录的影响，采用transwell 法检测IL-6中和抗体及IL-6受体（IL-6 receptor ，IL-6R ）中和抗体对PKCβⅡ高表达诱导HCC 细胞侵袭的影响，采用Western blot 检测信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STA T3）、P-STA T3的蛋白表达，采用非参数Spearman 检验分析HCC 组织中PKCβⅡ和IL-6表达的相关性。结果：采用PKCβⅡ高表达细胞的条件培养基处理可以提高HCC 细胞Huh7（P <0.01）和Hep3B （P <0.05）的侵袭能力；PKCβⅡ高表达显著提高上清液中IL-6的含量（P <0.01）及IL-6的转录（P <0.01）；IL-6中和抗体及IL-6R 中和抗体均可以抑制PKCβⅡ介导的HCC 细胞侵袭能力的增加（P <0.01），P-STA T3蛋白表达升高（P <0.05）；HCC 组织中PKCβⅡ和IL-6的表达呈正相关（r =0.697，P <0.01）。结论：PKCβⅡ通过IL-6自分泌途径促进HCC 细胞的侵袭。
［关键词］ 蛋白激酶C βⅡ；IL-6；自分泌；肝细胞癌；侵袭DOI: 10.19401/jki.1007-3639.2021.04.005
中图分类号：R735.7 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2021)04-0268-09
Protein kinase CβⅡ promotes invasion of hepatocellular carcinoma by modulating autocrine of IL-6 LIU Min 1,2, CHEN Tianliang 3, GUO Juan 4, YI Xue 1,2, GAO Hongquan 1, WU Jiacui 1, WANG Yu
xiao 1 (1. Department of Basic Medicine, Xiamen Medical College, Xiamen 361023, Fujian Province, China; 2. Key Laboratory of Functional and Clinical Translational Medicine, Xiamen 361023, Fujian Province, China; 3. Department of Clinical Medicine, Xiamen Medical College, Xiamen 361023, Fujian Province, China; 4. Department of Pathology, the Second Affiliated Hospital of Xiamen Medical College, Xiamen 361023, Fujian Province, China)
电力系统负荷预测Correspondence to: WANG Yuxiao E-mail: 1010531340@qq
［Abstract ］ Background and purpose: Multiple proinflammatory cytokines in tumorigenic microenvironment are involved in the acquired capability for invasive growth and metastasis. It is not clear whether protein kinase CβⅡ(PKCβⅡ) can modulate the secretion of proinflammatory cytokines to promote the progression of hepatocellular carcinoma (HCC). This study aimed to explore the function and mechanism of PKCβⅡ in the invasion of HCC to investigate the relationship between PKCβⅡ and tumor inflammatory microenvironment. Methods: The effect of conditioned medium from PKCβⅡ-overexpressing cells on the invasion of HCC cells was detected by the transwell assay. Serum-free culture supernatants were analyzed by cytokine arrays. The effect of PKCβⅡ overexpression on the expression of interleukin-6 (IL-6) in supernatants and at mRNA level was examined by enzyme-
《中国癌症杂志》2021年第31卷第4期269
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第七大高发和第四大致死性的恶性肿瘤［1］，中国是HCC大国，世界上每年近半数HCC新发和死亡病例均发生在中国［2］，虽然近年来对HCC的基础和临床研究有诸多进展，但HCC患者预后仍然很差，5年生存率仅10%［3］。HCC的复发转移是导致HCC患者死亡率居高不下的主要原因，深入研究其转移的机制，探究更加精确有效的靶点一直是HCC研究的重点和难点。越来越多的证据表明，在HCC发生、发展的过程中，肿瘤微环境与肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移密切相关［4］，肿瘤细胞或者肿瘤微环境中的细胞分泌的多种促炎因子、趋化因子等参与肿瘤的转移［5］，尤其是肿瘤细胞源性细胞因子可以通过自分泌途径参与肿瘤的生长、存活及转移［6］，或通过旁分泌途径重塑基质［7］，促进肿瘤的发展。蛋白激酶CβⅡ（protein kinase CβⅡ，PKCβⅡ）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶C家族，参与细胞增殖、存活、血管新生等生物学过程，PKCβⅡ在多种肿瘤中表达上调［8-10］，其高表达提示患者预后不良［11］。肺癌细胞高表达PKCβⅡ可以提高细胞的增殖、迁移能力［12］；胃癌中PKCβⅡ的激活参与斯钙素（stanniocalcin-1，STC-1）［13］介导的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，促进胃癌生长及血管新生，上述研究均表明PKCβⅡ在肿瘤的发展过程中发挥重要的作用。我们前期的研究［14］发现，PKCβⅡ通过调控上皮-间质转化介导HCC的转移，然而PKCβⅡ能否通过调节炎性因子参与HCC的侵袭尚不清楚。本文通过研究PKCβⅡ对HCC侵袭的影响及相关机制，探讨PKCβⅡ与肿瘤微环境之间的关系，对深入了解HCC的转移机制、寻HCC的新靶点具有重要意义。
1 材料和方法
1.1 细胞系及主要试剂
清华同方中国知网
本实验所用到的HCC细胞Huh7和Hep3B 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，transwell小室（8 μm）购自美国Costar 公司，基质胶购自美国BD公司，细胞因子抗体芯片购自美国RayBiotech公司，人白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、即用型高效免疫组织化学二抗试剂盒购自爱必信（上海）生物科技有限公司，反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，FastStart Essential DNA Green Master购自瑞士Roche公司，IL-6中和抗体、IL-6受体（IL-6 receptor，IL-6R）中和抗体购自美国R&D 公司，STAT3和p-STAT3购自美国Cell Signaling Technology公司，PKCβⅡ和IL-6抗体购自美国Abcam公司。
1.2 临床样本
选择2016年5月—2019年12月厦门医学院附属第二医院经病理学检查确诊的HCC患者20例，所有患者均无抗肿瘤史。本研究符合厦门医
linked immunosorbent assay (ELISA) and real-time fluorescence quantitative polymerase chain react
ion (RTFQ-PCR) respectively. The effects of IL-6 neutralizing antibody and IL-6 receptor (IL-6R) neutralizing antibody on PKCβⅡ overexpression-induced invasion of HCC cells were detected by the transwell assay. The expressions of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and P-STAT3 were detected by Western blot. Correlation of PKCβⅡ with the expression of IL-6 in clinical HCC cases was analyzed using the nonparametric Spearman test. Results: Conditioned medium obtained from PKCβⅡ-overexpressing cells significantly induced the invasiveness of Huh7 (P<0.01) and Hep3B (P<0.05), and the upregulated secretion of IL-6 (P<0.01) and mRNA level (P<0.01) upon PKCβⅡ overexpression were observed respectively. Administrations of IL-6 neutralizing antibody and IL-6R neutralizing antibody blocked PKCβⅡ overexpression-induced invasion of HCC cells (P<0.01). The protein level of P-STAT3 increased significantly upon PKCβⅡ overexpression (P<0.05). Immunohistochemical analysis also presented a strong positive correlation between PKCβⅡ and IL-6 expression in clinical HCC samples (r=0.697, P<0.01). Conclusion:PKCβⅡ promotes the invasion of HCC by modulating autocrine of IL-6.
［Key words］ Protein kinase CβⅡ; Interleukin-6; Autocrine; Hepatocellular carcinoma; Invasion
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学院伦理委员会相关规定，患者均自愿参与并签署知情同意书，标本切除后放置于-80 ℃冰箱保存。1.3 实验方法
1.3.1 构建稳定高表达PKCβⅡ的HCC细胞株sst华塑
电厂节能减排
将携带人PKCβⅡ基因的pLVX-puro-表达载体与pMDLg、pVSV-G、pRSV-Rev包装质粒在HEK-293T细胞中进行病毒包装，空载体作为对照组。将HCC细胞接种于2 cm细胞培养皿中，细胞密度40%~50%，第2天换液，加入终浓度为5 mg/L的聚凝胺（polybrene），病毒冰上融化后滴加到培养液内，混匀，8～12 h后换液继续培养，以1∶5~1∶3的比例进行细胞传代，培养过夜，使用1 mg/L的嘌呤霉素（puromycin）对细胞进行筛选，2~3周后得到稳定表达细胞。
1.3.2 收集条件培养基
稳定高表达PKCβⅡ的HCC细胞及对照用无血清DMEM培养基培养24 h，收集细胞上清液，于4 ℃ 300×g离心10 min，去除悬浮细胞及碎片，-20 ℃保存。
1.3.3 Transwell侵袭实验
用无血清培养基重悬细胞，每孔5×104个细胞，上室中预先加入按1∶6稀释的基质胶，下室加入完全培养基，培养24 h，PBS洗3次，采用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次，结晶紫染30 min，
PBS洗3次，棉签擦掉上室内的细胞，显微镜下每组随机选取5个视野进行计数，实验重复3次，每组3个复孔。
1.3.4 细胞因子抗体芯片检测
使用细胞因子抗体芯片Human Inflammation Array C3（美国RayBiotech公司）检测细胞上清液中细胞因子的水平，实验步骤参考厂商提供的方案。简述如下：收集无血清条件培养基，每个芯片孔中加入100 µL的1×封闭液，室温摇床上温育30 min，抽去封闭液，每孔加入100 µL的样品，4 ℃震荡温育过夜，弃去样品，每孔加入250 µL的1×洗液Ⅰ，清洗6次，每次震荡10 s，每孔加入250 µL的1×洗液Ⅱ，清洗5次，每次震荡10 s，每孔加入70 µL生物素标记抗体（事先用1×封闭液稀释），室温温育1~2 h，洗膜，每孔加入70 µL荧光剂-链霉亲和素（事先用1×封闭液1∶1 500稀释），避光室温震荡温育2 h，洗膜，利用GenePix 4000B Microarray Scanner扫描仪，532 nm激发波长进行扫描，采用AAH-INF-G3的数据分析软件计算各信号点灰度值。
1.3.5 ELISA检测
收集无血清条件培养基，各孔加入100 µL 标准品和实验样品，盖上贴膜，室温温育2 h，弃去液体，加入400 µL洗涤液洗涤，重复3次，拍干，每孔加入100 µL IL-6检测抗体，室温温育2 h，加入400 µL洗涤液洗涤，重复3次，拍干，每孔加入100 µL链霉亲和素-HRP，室温避光温育20 min，加入400 µL
洗涤液洗涤，重复3次，拍干，每孔内加入100 µL显液，室温避光温育20 min，每孔加入终止液50 µL，终止反应，450 nm波长测量各孔的吸光度（D）值，设定540 nm作为校正波长。
1.3.6实时荧光定量聚合酶链反应（r e a l-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测
将稳定高表达PKCβⅡ的HCC细胞及对照细胞提取总RNA，采用反转录试剂盒将等量RNA （2 μg）反转录成cDNA，应用Light Cycler 96 RTFQ-PCR仪，使用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法，以比较C T值法（2-ΔΔC T法）计算相对定量。所用到的引物序列I L-6有义链为A G A C A G C C A C T C A C C T C T T C A G，反义链为TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG；
I L-6R有义链为G A C T G T G C A C TTGCTGGTGGAT，反义链为ACTTCCTCACC A A G A G C A C A G C；G A P D H有义链为5’-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3’，反义链为5’-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3’。预温育95 ℃ 600 s，循环条件95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共45个循环，溶解95 ℃ 10 s，65 ℃60 s，97 ℃ 1 s。
1.3.7 抗体中和实验
对数生长期的细胞加入I L-6中和抗体（5 μg/mL）或IL-6R中和抗体（5 μg/mL）预处理1 h，PBS洗3次，胰酶消化，无血清培养基重悬，用于细胞侵袭实验。
1.3.8 蛋白质印迹法（Western blot）检测
细胞用冷P B S洗3次，加入十二烷基硫
刘 敏，等 蛋白激酶CβⅡ通过IL-6自分泌途径促进肝细胞癌侵袭的研究
《中国癌症杂志》2021年第31卷第4期
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酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ，SDS-PAGE ）裂解液，提取细胞总蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid ，BCA ）试剂盒进行蛋白定量。每组取等量蛋白用10%SDS-PAGE 分离蛋白后，以湿转法转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride ，PVDF ）膜上，加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h ，加入一抗4 ℃温育过夜，TBST 洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗，室温温育1 h ，滴加电化学发光（electrochemical luminescence ，ECL ）显影液显影。以GAPDH 作为内参。1.3.9 免疫组织化学法检测
取临床HCC 患者癌组织石蜡切片，按照试剂盒说明书进行免疫组织化学染，DAB 工作液显，苏木精复染，盐酸乙醇分化、脱水，中性树脂封片。光学显微镜观察PKC βⅡ、IL-6的表达情况。为了进行PKC βⅡ和IL-6的相关性分析，本研究以免疫组织化学染评分反映PKC βⅡ和IL-6的表达水平，免
疫组织化学染评分=染强度×阳性细胞比例（%）。染强度评分标准：不着，0分；黄，1分；棕黄，2分；棕褐，3分；阳性细胞所占观察细胞百分比评分标准：<5%，0分；5%~25%，1分；26%~50%，2分；
51%~75%，3分；>75%，4分。1.4 统计学处理
所有统计学分析均采用SPSS 22.0软件进行，结果以x±s 表示，实验两组间比较采用两个独立样本的t 检验分析，方差齐且服从正态分布的组间差异采用单因素方差分析，PKC βⅡ和IL-6表达的相关性分析采用非参数Spearman 检验。P <0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 PKC βⅡ高表达细胞的条件培养基增强HCC 细胞的侵袭能力
本研究采用取自PKC βⅡ稳定高表达HCC 细胞组和对照组细胞的条件培养基（conditioned medium ，CM ）处理HCC 细胞Huh7和Hep3B 24 h ，通过transwell 法检测细胞侵袭能力的变化。结果显示，与来自对照组的条件培养基比较，PKC βⅡ高表达细胞的条件培养基能够显著增强Huh7的侵袭能力（P <0.01，图1A ）；在HCC 细胞Hep3B 中，PKC βⅡ高表达细胞的条件培养基同样能够增强细胞的侵袭能力（P <0.05，图1B ）。上述结果表明，自分泌途径可能参与了PKC βⅡ的促HCC 侵袭作用。
图 1 PKC βⅡ高表达细胞的条件培养基提高HCC细胞的侵袭能力
Fig. 1 Conditioned medium from PKCβⅡ-overexpressing cells promoted the invasion of HCC cells
A: The invasive ability of Huh7 was tested by transwell assay; B: The invasive ability of Hep3B was tested by transwell assay; *: P <0.05, compared with control group; **: P
<0.01, compared with control group
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2.2 PKC βⅡ促进IL-6的分泌
b衰变采用细胞因子抗体芯片检测PKC βⅡ高表达组和对照组细胞因子分泌的变化，将PKC βⅡ高表达前后细胞因子的相对量进行比较，结果显示，在表达水平提高的细胞因子中，IL-6的提高最为显著（图2A ）。ELISA 结果显示，在HCC 细胞Hep3B 中高表达PKC βⅡ可以提高上清液中IL-6
的含量（P <0.01，图2B ），在HCC 细胞Huh7中高表达PKC βⅡ也观察到了类似的结果（P <0.01，图2B ）；RTFQ-PCR 结果显示，在HCC 细胞Hep3B 中高表达PKC βⅡ可以上调IL-6的转录（P <0.01，图2C ），在HCC 细胞Huh7中高表达PKC βⅡ也观察到了类似的结果（P <0.01，图2C ）。上述结果表明，PKC βⅡ可以促进IL-6的分泌。
图 2 PKC βⅡ促进IL-6的分泌 Fig. 2 PKCβⅡ promoted IL-6 secretion
A: The effect of PKCβⅡ overexpression on the pattern of cytokines using cytokine antibody arrays, th
e red box represented the expression of IL-6; B: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the secretion of IL-6 upon PKCβⅡ overexpression; C: RTFQ-PCR was used to detect the mRNA level of IL-6 upon PKCβⅡ overexpression; **: P <0.01, compared with control group
2.3 PKC βⅡ通过IL-6自分泌方式介导HCC细胞的侵袭
为了验证IL-6是否参与PKC βⅡ的促HCC 侵袭作用，抗体中和实验结果显示，IL-6中和抗体可以抑制HCC 细胞Huh7的侵袭能力（P <0.05，图3A ），而对PKC βⅡ高表达的Huh7细胞，IL-6中和抗体可以更加明显地抑制其侵袭能力（P <0.01，图3A ）；在HCC 细胞Hep3B 中，IL-6中和抗体对其侵袭能力有所抑制，但差异并无统计学意义（P >0.05，图3B ），而对PKC βⅡ高表达的Hep3B 细胞，IL-6中和抗体可以抑制其侵袭能力的增强（P <0.01，图3B ）。上述结果表明，
PKC βⅡ介导HCC 细胞侵袭能力的增强是通过IL-6自分泌方式实现的。
2.4 IL-6/STAT3信号通路参与PKC βⅡ的促HCC细胞侵袭
通过RTFQ-PCR 检测PKC βⅡ高表达HCC 细胞Huh7和对照组细胞中IL-6受体的表达，结果表明，PKC βⅡ可以提高IL-6受体的转录（P <0.01，图4A ）；抗体中和实验的结果显示，IL-6受体中和抗体可以抑制HCC 细胞Huh7的侵袭能力（P <0.05，图4B ），而对PKC βⅡ高表达的Huh7细胞，IL-6受体中和抗体可以显著抑制其
刘 敏，等 蛋白激酶CβⅡ通过IL-6自分泌途径促进肝细胞癌侵袭的研究
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