细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell Mollmmunol)2021，37( 1)39 •论著•文章编号：1007-8738(2021 )01>0039~08
磷脂酰肌醇3激酶p(PI3Kp)和PI3K8在K IT突变介导的细胞转化中起不同作用
张少婷，朱光荣，石君，杨继辉，蒋宗英，张良颖，窦凯凯，孙建民*
(宁夏医科大学基础医学院病原生物学与医学免疫学系，宁夏银川750004)
[摘要]目的探究磷脂酰肌醇3激酶(P I3K)的不同亚型在三型酪氨酸激酶受体KIT突变介导的信号传递及细胞增殖中的作 用。方法在B aF3细胞中稳定表达野生型KIT及胃肠间质瘤中常见的KIT突变V560D、W557K558del，分别用PI3K a、P I3KP、P I3K5亚型特异性抑制剂或者广谱P I3K抑制剂处理细胞，免疫沉淀法和W estern blot法检测KIT及其下游信号活化情况。胃肠 间质瘤G IST-T1细胞采用相同药物及浓度处理，免疫共沉淀和W estern blot法检测KIT及其下游信号的活化情况，噻唑蓝 (M T T)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组相比，在表达野生型KIT及其突变体的B aF3细胞中，P I3K8亚型特异性抑制剂对KIT及其下游信号分子蛋白激酶B(AKT)和胞外信号调节激酶（ERK)活化的抑制作用最强，其次为 P I3K a和P I3KP亚型特异性抑制剂。在G IST-T1细胞中，P I3KP亚型特异性抑制剂对KJT及其下游信号活化的抑制作用最强，其次为P I3K&和P I3K a亚型特异性抑制剂。结论在B aF3细 我不是最弱小的教学设计
胞中，P I3KS亚型在KIT活化及其下游信号传递中起主要作用，而在G IST-T1细胞中，P I3Kp亚型在KIT活化及其下游信号传递中起主要作用，这些结果表明不同P I3K亚型在KIT突变介导 的细胞转化中起不同作用，且在不同的细胞中其作用也有不同。
[关键词]胃肠间质瘤（GIST)；三型酪氨酸激酶受体；KIT；磷脂酰肌醇-3-激酶（P I3K)
[中图分类号]R573, S941.3 [文献标志码]A
PDK isoforms PDKp and PDK8 play different roles in KIT mutation-mediated cell transformation
ZHANG Shaoting, ZHU Guangrong, SHI Jun, YANG Jihui, JIANG Zongying, ZHANG Liangying, DOU Kaikai, SUN Jianmin*
才利民
D epartm ent of Pathogenic Biology and M edical Im m unology,School of Basic Medicine,Ningxia M edical University,Yinchuan 750004, C hina
* C orresponding author,E-mail：jianmin.sun@nxm u.edu
[A bstract]Objective To investigate the role of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) isoforms in type I D receptor tyrosine kinase KIT mutation-mediated signaling and cell proliferation. Methods The wild-t
ype KIT and the common KIT mutations V560D and W557K558del in gastrointestinal stromal tumors (G IS T) were stably expressed in BaF3 cells. The cells were treated with PI3K isoforms PI3K a, PI3Kp and PI3K8 specific inhibitors or pan PI3K inhibitor. The activation of KIT and Its downstream signals was detected by immunoprecipitation and Western blot analysis. GIST-T1 cells were treated with the same drug, and the activation of KIT and its downstream signals was also detected by immunoprecipitation and Western blot analysis, and cell proliferation and apoptosis were detected by MTT assay and flow cytometry, respectively. Results Compared with the controls, in BaF3 cells expressing wild-type KIT and its mutants, the activation of KIT and its downstream signaling molecules AKT and ERK was inhibited the most by PI3K8 specific inhibitor, followed by the specific inhibitors of PI3Ka and PI3Kp subtype. In G IS T-T l cells, the activation of KIT and its downstream signals was inhibited the most by PI3Kp specific
收稿日期：2020~09-29；接受日期：2020-12^04
基金项目：国家自然科学基金(81660473)
作者简介：张少婷（1993 -)，女，陕西铜川人，硕士研究生
T el：182****7662；E-m ail：182****************
黄天道
* 通讯作者，孙建民，E-m ail: ********************
40细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Iimmmol)2021，37(1)
inhibitor, followed by PI3K5 and PI3Ka specific inhibitors. Conclusion In BaF3 cells, PI3K8 subtype plays a major role in KIT activation and its downstream signal transduction, while in GIST-T1 cells, PI3K(3 subtype plays a major role in KIT activation and its downstream signal transduction. These results indicate that PI3K isoforms play different roles in KIT mutation-mediated cell transformation depending on the host cells.
[Key words] gastrointestinal stromal tumors (G IS T)；type H I receptor tyrosine kinase；K IT；phosphatidylinositol 3-kinase (P I3K)
胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，G I S T)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，该肿瘤的发 病率约为每年每百万人4~20例[12]。在该肿瘤的基 因测序中发现了多种基因突变，其中最常见的突变 基因是三型酪氨酸激酶受体K I T的编码基因c-kit，约占所有患者的70% ~80%[3]。正常情况下，KIT 与其配体干细胞因子（stem cell factor,S C F)结合后活 化并激活下游信号通路，而肿瘤中的突变型K I T无 需配体即可发生自活化，从而引起细胞癌变[4]。在 K I T下游信号通路中，肉瘤基因/胞外信号调节激酶(sarcoma gene/extracellular signal regulated kinase, Src-E R K)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶
B/哺乳动 物雷帕霉素祀蛋白（phosphatidylinositol3 kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/A K T/ m T O R)通路在K I T介导的细胞存活和增殖中起主要 作用[5]。伊马替尼（imatinib)作为G I S T靶向的 一线药物，能够抑制K I T的活性，对G I S T具有良好 的疗效，能够延长G I S T患者平均约5年的生存期。但研究表明，仅有少部分患者有效，大部分患者最终 由于肿瘤获得了耐药性K I T二次突变或者激活了其 他信号通路而复发[6_7]。
PI3K是一种细胞内脂质激酶，在细胞增殖、分化、迁移等过程中起非常重要的作用PI3K 及其下游信号通路是目前人类恶性肿瘤中最常见 的致病信号通路之一，它在卵巢癌、乳腺癌、胃癌 等在内的多种癌症中存在过度活化[9]。目前很多 PI3K及其下游信号分子的抑制剂正处于肿瘤 的临床实验阶段，个别已经批准用于临床[1°]。PI3K有三种不同类型，其中I A型的研究最为广 泛，I A型PI3K由调节亚基和催化亚基组成，催 化亚基包括 pllOot、pll〇p、p llOS 和 pll〇7[8]。在本研究中，我们分别采用表达野生型和突变型 K I T的细胞系以及G I S T细胞，并利用不同PI3K 亚型的特异性抑制剂研究了不同PI3K亚型在KIT 信号传递及其介导的细胞转化中的作用，探究了不同亚型的PI3K抑制剂在G I S T中的可能应 用，为PI3K抑制剂对G I S T的提供了实验基础。
1材料和方法
1.1材料
PI3K a(pi10o t)抑制剂阿培利司（apelisib)、P B K p(p l l O p)抑制剂 G S K263771、PI3K8(pll08)抑制剂艾代拉里斯（idelalisib)、PI3K广谱抑制剂库潘 尼西（copanlisib)购自 M C E 公司；R P M I1640 和D M E M培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自 Gibco公司；兔抗胞夕卜信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase,E R K)抗体、山羊抗蛋白激酶 B (protein kinase B,P K B/A K T)抗体、抗憐酸化的 E R K (phosphorylatedERK,p-E R K)抗体、H R P标记的驴 抗山羊IgG、H R P标记的小鼠抗肌动蛋白(P-actin)抗体购自Santa Cruz公司；小鼠抗憐酸化检 测抗体（anti-phosphotyrosine antibody，p Y)购自 Millipore公司；兔抗K I T抗体购自Biolegend公司；兔抗磷酸化的 A K T(Ph〇sPh〇rylated A K T，p-A K T)抗 体购自Cell Signaling Technology公司；H R P标记的山 羊抗兔IgG、H R P标记的山羊抗小鼠I g G购自 Abbkine公司；藻红蛋白标记的膜联素V/7-氨基放 线菌素D(annexin V-phycoerythrin/7-araino-actinomycin D，annexin V-P E/7-A A D)细胞调亡检测 试剂盒购自B D公司；噻挫蓝（methyl thiazolyl te t r a^olium，M T T)法细胞增殖检测试剂盒购自凯基生物 技术有限公司；BaF3细胞、GIST-T1细胞系、EcoPack 细胞购自C o s m o公司。白细胞介素3 (interleukin3, IL-3)、二甲基亚讽（dimethyl sulfoxide,D M S0)、S C F购自Sigma Aldrich公司；青链霉素混合液购自Solarbio 公司；Lipofectamine™2000、磁珠 Dynabeads™Protein G购自Invitrogen公司。
1.2方法
1.2. 1细胞培养及实验分组BaF3细胞系以含
1期张少婷，等.磷脂酰肌醇3激酶B(PI3KB)和PI3KS在KIT突变介导的细胞转化中起不同作用41
100 m L/L胎牛血清、10 n g/m L小鼠 IL-3、100 I U/m L 青霉素、100 链霉素的R P M I1640培养基培养；GIST-T1细胞系以含150 m L/L胎牛血清、100 IU/m L青霉素、100 pg/m L链霉素的D M E M培 养基培养；E c o P a c k细胞以含100 m i y L胎牛血清、100 IU/m L青霉素、100 pg/m L链霉素的D M E M培 养基培养，取状态良好，处于对数生长期的细胞进行 实验。
表达野生型K I T(KIT-)及其突变体V560D和W557K558del的BaF3细胞，首先分为空白对照组、p l l O a亚基抑制剂apelisib ( 1m mol/L)处理组、pll〇P亚基抑制剂G S K263771(1 mmol/L)处理组和 pll08亚基抑制剂idelalisib(l mmol/L)处理组及 PI3 K广谱抑制剂copanlisib(50 nmol/L)处理组，由于携带野生型K I T细胞无法自活化，突变型自活化 较弱，需要给与S C F刺激进行蛋白活化检测[11]。因此，每个处理组再分为不加S C F刺激组和S C F (100 ng/m L)刺激组，共10组，作用时间为4 h，并 用Western blot法检测K I T及其下游信号活化情况；GIST-T1细胞实验共分为5组，分别为空白对照组、pi10a亚基抑制剂apelisib ( 1m m o l/L)处理组、pll〇(3亚基抑制剂G S K263771(1 mmol/L)处理组和 pll08亚基抑制剂idelalisib(l m m〇]/L)处理组及 PI3K广谱抑制剂 copanlisib(50 nmol/L)处理组，Western blot法检测作用时间为8 h，细胞增殖实验作 用时间为48 h，细胞凋亡实验作用时间为96 h。
1.2. 2 建立稳定表达野生型K I T及其突变体 V560D、W557K558del 的BaF3 细胞系 将 48 |xL Lipofectamine™ 2000 加人 1.5 m L D M E M 培养基中，混勻，室温孵育5 min。另准备3组500 j j l L D M E M 培养基，分别加人8网？1^(^1)11«)/的01\碑5(^- puro/ KIT/V560D、pMSCVpuro/KIT/W557K558del质 粒，向各管中加人孵育好的Lipofectamine™ 2000、
D M
E M培养基混合液500斗，混匀后室温孵育
30 min。取生长状态良好，汇合度达到60% ~ 80% 的E c o P a c k细胞，向上清中加入孵育好的Lipofectamine1''2000、D M E M培养基以及质粒的混合 液，混匀后于培养箱中孵育48 h。48 h后收集病毒 上清，感染BaF3细胞；经1.2 pg/m L嘌呤霉素筛选 后，经流式细胞术确认K I T在细胞内的表达。
1.2.3 M T T法检测GIST-T1细胞增殖取对数生长 期的GIST-T1细胞，调整细胞数为80 000个/m L，分别设置空白对照组、pl l〇a亚基抑制剂apelisib (1 mmol/L)处理组、p l l O p亚基抑制剂G S K263771 (1 mmol/L)处理组和p l l O S亚基抑制剂idelalisib (1 mmol/L)处理组及PI3K广谱抑制剂copanlisib (50 nmol/L)处理组，将细胞接种于96孔板，每孔 100 j j l L，每个处理组设置5个复孔。培养箱中培养 48 h后，加人 5 m g/m L M T T溶液 50 j j l L，37 t孵育 4 h，弃去上清，每孔加人150 j j l L D M S0，振荡
混匀 后，在酶标仪上于490 run波长处检测吸光度值。
1.2.4 Annexin V-P E/7-A D D双标记结合流式细胞 术检测GIST-T1细胞凋亡取生长状态良好，处于对 数期的GIST-T1细胞接种于24孔板，每孔500卟、1x105个细胞，设置空白对照组、pi10a亚基抑制剂 apelisib( 1m m o l/L)处理组、pi10(3亚基抑制剂
G S K263771(1 mmol/L)处理组和p l l O S亚基抑制剂 idelalisib( 1mmol/L)处理组及PI3K广谱抑制剂copanlisib(50 nmol/L)处理组，每组3个复孔。于培 养箱中处理96 h后，收集上清并消化贴壁细胞。P B S清洗2次，用100 (xL 1x缓冲液重悬细胞，加入 1(xL annexin V-P E混匀后，加入 1(xL7-A D D，室温 避光孵育15 m i n后，重悬于500 jiL缓冲液中，上机 检测。
1.2.5 Western blot 法检测 BaF3 细胞和 GIST-T1 细胞中K I T及其下游信号蛋白表达取处于对数生长 期表达野生型K I T或K I T突变体V560D、W557K558del的BaF3细胞，计数后每株取6 x107个 细胞，每株细胞设置空白对照组、p l l O a亚基抑制剂 apelisib(1m m o l/L)处理组、pi l〇p亚基抑制剂
G S K263771(1 mmol/L)处理组和p l l O S亚基抑制剂 idelalisib(1m m o l/L)处理组及PI3K广谱抑制剂copanlisib(50 nmol/L)处理组，共5组。每个处理组 再分为无S C F组和S C F(100 ng/m L)刺激组。离心细 胞，P B S洗2次，弃上清，首先分成5组药物处理组，每组细胞用1〇 m L R P M I1640不完全培养基重悬，处 理组加入对应抑制剂，在培养箱中饥饿培养4 h，以去除血清和IL-3对后续蛋白检测的影
响，即去除本 底效应[12]。离心后，每组制成2m L细胞悬液，每组 分出1/2给予100 n g/m L S C F刺激2 m i n，随后加入 4 m L预冷的P B S, 1000 r/m i n离心5 m i n后弃上清。加裂解液1m L于冰上裂解15 m i n后，12 000 r/m i n离心1m i n；将上清收集于1.5 m L离心 管中，取少部分加人上样缓冲液，99 加热5 m i n ，
42细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Imrmm〇l)2021，37( 1)
用于检测A K T及E R K磷酸化；剩余部分各加入兔抗 K I T抗体0.5网，4 °(：旋转孵育1h后，加入磁珠 Dynabeads™Protein G 10 [i L’继续 4 旋转解育 30 m i n；用500 ~900斗裂解液洗3次，加人30 (xL 上样缓冲液，99 t；加热5 m i n，经聚丙烯酰胺凝胶电 泳分离后，用于检测K I T活化。
取状态良好的GIST-T1细胞，P B S T洗涤后，加入含20 m i y L血清D M E M培养基；设置空白对照组、pllOo(亚基抑制剂apelisib ( 1m m o l/L)处理组、p l l O p亚基抑制剂G S K263771 (1mmol/L)处理组和 pi10S亚基抑制剂idelalisib(1mmol/L)处理组及 PI3K广谱抑制剂copanlisib (50 nmol/L)处理组，共 5组。加入对应抑制剂后，于培养箱孵育8 h。收集 细胞。提取蛋白，取少部分蛋白直接制备蛋白样品，用于检测K I T下游信号活化，剩余部分采用与BaF3细胞相同的方法进行处理以检测K I T活化。
本研究中所有蛋白样品经80 g/L S D S-P A G E后，半干转法转移到P V D F膜上；常温下以P B S T封闭 4 h，封闭好的膜根据所检测蛋白分子量的不同裁开，分别孵育小鼠抗PY抗体（1 : 1000 )、兔抗 p-
E R K抗体(1:1000)、兔抗 p-A K T 抗体（1:1000)，4 t冰箱孵育过夜；P B S T洗涤后，分别加入H R P标 记的山羊抗小鼠I g G(l:50 000)和H R P标记的山羊 抗兔IgG(1:50 000)，室温孵育4 h;P B S T洗涤后，使用E C L显影液显影，自动成像仪采集图片。采集完 磷酸化信号的膜用16 g/L氢氧化钠溶液常温下洗膜 20 m i n，P B S T清洗后，分别孵育兔抗K I T抗体 (1:1000)、山羊抗A K T抗体（1:1000)、兔抗E R K抗 体（1:1000), 4 t冰箱孵育过夜。P B S T洗涤后，分 别加人H R P标记的山羊抗兔IgG(l:50 000)和H R P 标记的驴抗山羊IgG(l:50000)，室温孵育2h。洗涤 后，使用E C L显影液显影，孵育完E R K抗体的膜, 用16 g/L氢氧化钠洗膜后，孵育H R P标记的小鼠抗 p-actin抗体，室温孵育30 m i n；洗涤后，使用E C L显影液显影。自动成像仪采集图片后，用Image L a b软件进行灰度值分析。
1.2.6统计学分析利用Image L a b软件对Western blot结果进行吸光度值分析，用GraphPad8.0软件进 行统计学分析，并绘制统计图。计量资料以表示，组间两两比较采用Dimnett-t检验，多组间比较 采用单因素方差分析，以P<〇.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 p llO S在BaF3细胞中K IT诱导的A K T和ERK活化中起主要作用
首先建立稳定表达野生型K I T(KIT -)以及 G I S T中最常见的K I T突变体V560D和W557K558d e l的B
a F3细胞模型，经流式细胞术确 认K I T在细胞内的表达。经Western blot法检测 K I T下游信号分子A K T和E R K的活化。I P法沉 淀K I T后，检测其活化。结果显示，与空白对照 组相比，pl105抑制剂对野生型和突变型K I T的下游信号分子A K T的活化抑制作用最强，其次是 pllOct抑制剂，pll〇(3抑制剂作用最弱。E R K的活化结果与A K T活化相同（图1)。
2.2 p ll0(3在GIST细胞的AKT和ERK活化中起主要作用
通过应用各PI3K亚型抑制剂及广谱PI3K抑制剂处理G I S T-T1细胞，用Western blot技术对各 组细胞K I T下游信号通路蛋白表达情况进行检测，I P法沉淀K I T后检测其活化。与对照组相比，在G I S T细胞中，P110p抑制剂对K I T的下游信号 分子A K T和E R K的活化抑制作用最强，其次是 PI3K S抑制剂，而PI3K a抑制剂几乎没有抑制作 用（图2)。
2.3 pllO p在GIST细胞增殖和存活中起主要作用生存与尊严
用各抑制剂处理G I S T-T1细胞后，用M T T法 检测细胞增殖。结果显示：与对照组相比，P l l O p 抑制剂对G I S T-T1细胞的增殖具有较强的抑制作 用，差异有统计学意义（P<〇.05，图3A)。此外，经流式细胞术检测细胞凋亡，与细胞增殖结果类 似，pll〇P抑制剂引起的GIS T-T1细胞凋亡率最 高，差异有统计学意义（P<〇.〇1，图3B、C )。
1期张少婷，等.磷脂酰肌醇3激酶MPI 3KB )和PI 3K 5在KIT 突变介导的细胞转化中起不同作用43
A ：流式细胞术检测K JT 的表达；
B ：在转染K IT 的B aF 3细胞中检测K IT 及其下游信号AKT、E R K 的活化程度；C: B a F 3/K IT -细胞p-AKT、AKT 水平的半定量分析；D: B a F 3/K IT -细胞p-ERK 、E R K 水平的半定量分析；E ：在转染K IT 突变体V 560D 的B aF 3细胞中检测K IT 及其下游信号 AKT、E R K 的活化程度；F: B a F 3/K IT -/V 560D 细胞p-AKT、A K T 水平的半定量分析；G: B a F 3/K IT -/V 560D 细胞p-ERK、E R K 水平的半定量 分析；H ：在转染K IT 突变体W 557K 558del 的B a F 3细胞中检测K IT 及其下游信号AKT、E R K 的活化程度；I: B aF 3/K IT -/W 557K 558d el 细胞 p-AKT、A K T 水平的半定量分析；J: B a F 3/K IT -/W 557K 558d el 细胞p-ERK、E R K 水平的半定量分析.1：空白对照无S
C F 刺激组；2：空白对照 lO O ng/m LSC F 刺激组；3: 1 m m ol/LPI3K a 抑制剂 alpelisib 处理组，无 SCF 刺激；4: 1 m m ol/LPI3K a 抑制剂 alpeiisib 处理组，lO O ng/m LSC F 刺 激；5: 1 m m ol/LP
I3K p 抑制剂 GSK2636771 处理组，无 SCF 刺激；6: 1 mmol/LPI3Kp 抑制剂 GSK263OT1 处理组，100ng/mLSCF 刺激；7: 1 mmol/L PI3K5 抑制剂 idelalisib 处理组，无 SCF 刺激；8: 1 mmol/L PI3KS 抑制剂 idelalisib 处理组，100 ng/m L SCF 刺激；9: 50 nmol/L PI3K 广谱抑制剂 copanlisib 处理组，无 SCF 刺激；10: 50 nmol/L PI3K 广谱抑制剂 copanlisib 处理组，100 ng/m L SCF 刺激• a 尸 <0.05, bP <0.01 vs 1.
图1建立表达野生型K IT 及其突变体V 560D 和W557K558del 细胞系以及给予不同处理后K IT 及其下游信号蛋白的表达A
W557K558del p-AKT AKT 0 102 103 104 1050 102 103 104 105 0 102 103 104 105AKT-PE
05050□ AKT
g p-AKT马绿家
2 3 4 5 6
BaF3/KJT-/V560D 123456789 10、KT \KT M ictin H
总细胞裂解液P Y 2.01.5 1.03.5 〕.0m
ERK m p -
e r k 1I
b 11A L
2 3 4 5 6
□ AKT |1 23 4567 89 10
—_m ^___———
• ••蠢鑛|
E l
总细胞裂解液
□
ERK m p -er k
b b
国企备忘录
^ 丨丨A 2 3 4 5 6 7 8 9 10
□ AKT
g P-AKT
2 3 4 5 6 7 8 9
BaF3/KIT- AV557K558del
1 2 3 4 57 8 9 10
押 a 隊
总细胞裂解液
t 羼11 8 U
2
H E 1
E P -S I 囵P -g H 0^^G D 5 0
5
0u l .
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