多感官·论著·P e r2－shＲN A 慢病毒构建及嘌呤霉素筛选P e r2低表达的细胞株胡书刚
尹磊1 ，王成泉1 ，王珺1 ，夏鹤春2
( 1〃宁夏医科大学，银川750004;2〃宁夏医科大学总医院神经外科，银川750004)
摘要: 目的构建人Peri o d2( Per2)基因shＲNA 慢病毒。方法设计并合成3 对特异性人Per2 基因shＲNA 靶序列，构建到pENTＲT M / U6( GV112)慢病毒载体中，包装慢病毒，用real － time PCＲ筛选取最佳片段。对感染的U343 细胞，经嘌呤霉素初步筛选，Western bl o t 鉴定Per2 蛋白表达，得到Per2 低表达的细胞。结果成功构建了具有Per2 沉默效应的shＲNA 慢病毒。结论此次包装的慢病毒可以成功抑制Per2 基因在胶质瘤U343 细胞中的表达，并可用嘌呤霉素筛选低表达细胞株。 关键词: Peri o d2 基因; shＲNA; U343 细胞；慢病毒
中图分类号: Q78 文献标识码: A
Period2 ( Per2 ) 基因是生物钟必不可少的组成部分，不仅具有调节生理节律的作用，还与动物和人的癌症发生有关［1］。当Per2过表达时，可以显著抑制乳腺癌、结肠癌等肿瘤组织的生长，促进细胞发生凋亡反应［2 － 3］。Per2在胶质瘤瘤组织和周围非瘤组织中，存在着差异性表达［4］。为深入研究Per2对胶质瘤细胞的作用机制，需要筛选Per2长期稳定低表达的细胞系，因此我们设计并构建s hＲNA
慢病毒，并用嘌呤霉素筛选，以期得到稳定沉默Per2的胶质瘤细胞株。
1材料与方法
1〃1主要材料与试剂人胶质瘤细胞株U343 购自广州吉妮欧生物公司; 慢病毒载体及慢病毒包装系统L entivector Packaging K it购自上海吉凯基因化学公司; 限制性内切酶Agel/E coＲI和连接试剂盒购自NE B 公司; 质粒提取试剂盒、逆转录试剂盒、切胶回收试剂盒购自Qiagen公司; 转染试剂L i pof ectamine2000、ＲNA抽提试剂T ri z ol 1〃2方法
1〃2〃1Per2－s hＲNA慢病毒干扰载体的构建根据Genebank中人Per2基因mＲNA序列(G e- neID: N M_022817)，借助siＲNA设计软件设计3 条Per2－ＲNAi( a～c) s iＲNA干扰序列。同时设计1条阴性对照序列，通过Genebank验证该阴性对照序列对任何基因均无干扰效应。在5’端添加CC GG，3’端添加TTTTT G，中间加入L oop环( CTC GAG) ，再在两端分别加入限制性内切酶A ge I和E coＲI的酶切位点黏性末端。将这些单链DNA送至上海吉凯基因化学公司，合成Per2纯化的s hＲNA Oli go 片段。
表1P e r2基因s iＲNA靶位点寡核苷酸序列
质粒名称寡核苷酸序列
5＇－ ACGAGAATGAAATCCGCTA － 3＇Per2 －ＲNAi( a)
3＇－ TGCTCTTACTTTAGGCGAT － 5＇
5＇－ CAGAGTCCAGATACCTTTA － 3＇Per2 －ＲNAi( b)
3＇－ GTCTCAGGTCTATGGAAAT － 5＇
5＇－ AAATTGTTTGTTCCAGGAT － 3＇
购自Invitr ogen公司; cDNA逆转录试剂盒、Ｒeal－time P CＲ试剂盒购自Fermentas公司; BC A蛋白质定量试剂盒、细胞及组织总蛋白抽提试剂盒、Per2 －ＲNAi( c)
Per2 －ＲNAi( NC)
3＇－ TTTAACAAACAAGGTCCTA － 5＇
5＇－ TTCTCCGAACGTGTCACGT － 3＇
3＇－ AAGAGGCTTGCACAGTGCA － 5＇
Western blot试剂盒购自南京凯基生物公司。兔抗人Per2多抗购自Abcam公司，鼠抗β－Actin 抗体、羊抗兔、羊抗鼠I gG 二抗购自北京全式金生物公司。
收稿日期: 2013－10－06
基金项目: 国家自然科学基金(81160313)1〃2〃2将合成的Per2－s hＲNA片段插入到GV112慢病毒载体中将合成好的DNA O li go 溶解并稀释成终浓度100μmol·L －1。应用P CＲ仪使正义链、反义链退火形成双链，退火条件为: 95℃，5m in; 85℃，5min; 75℃，5min; 70℃，5m in。将得到的s hＲNA片段稀释成终浓度
－1
作者简介: 尹磊(1985－)，女，河北人，在读硕士研究生，从事胶质20n mol·L 。用限制性内切酶A ge I和E coＲI
瘤研究。
通信作者: 夏鹤春。E － mail:x hechu n@ali y un〃 c o m 对慢病毒载体GV112进行双酶切，得到的产物经琼脂糖电泳分离、割胶回收和纯化后稀释成
50m g·L －1，并与s hＲNA片段在22℃水浴中进
行连接反应。取5μL 连接产物转化感受态大肠
杆菌DH5α，涂布于LB 平板抗性培养。挑取单克
隆菌落接种于LB 培养液，37℃摇菌过夜，离心收
集细菌并提取质粒DNA，对其进行A ge I和E coＲI
双酶切，将鉴定正确的质粒送交上海吉凯基因
化学公司测序。
1〃2〃3慢病毒包装取对数生长期的293T 细胞，以6×106 ·m L －1 的细胞数接种于培养皿，放
置37℃、5% C O2 恒温培养箱培养24h，在细胞生
长饱和度达到70%～80%时，加入各DNA溶液( pG C － L V质粒载体、辅助质粒载体pHelper1.0、pHelper2.0) 与L i pof ectamine2000脂质体进行共
转染。48h后，收集293T 细胞上清液，于4℃，4000×g条件下离心10m in。再用直径为0.45μm
的滤器过滤上清液并分装。
1〃2〃4药筛法测定慢病毒滴度以4×104 个/
孔的细胞数量接种96孔板，通过倍比稀释将含10、1…10－6 μL 的病毒分别加入8个实验孔，总体
积均为100μL，24h后加入嘌呤霉素筛选，终浓度
为2〃7μg·m L －1 。传代3代后，于高倍镜下观察
活细胞数，根据“病毒滴度=活细胞数/病毒原液量”，分别计算各组病毒的病毒滴度。
1〃2〃5病毒转染及Per2低表达细胞株的筛选
U343细胞用含10%F BS 的ＲP M I1640培养基培养，并维持5% C O2 、37℃恒温的条件。取生长状态
良好的细胞，以2×105 个/孔的细胞数量接种于6
孔板，待细胞饱和度达30% ( 24h内) ，加入5μL 滴
度为6〃0×108 T u·m L －1 的病毒( M OI: 2) ，10h后
更换新鲜培养基继续培养24h，再向各孔中加入嘌
呤霉素( 终浓度2〃7μg·m L －1 ) 进行筛选。每隔24 h
更换一次含嘌呤霉素的培养基，每隔2d传代一次，药筛式筛选传代4代后收集细胞，应用real－time
P CＲ和Western－bl o t检测Per2的表达情况。
1〃2〃6Ｒeal－time P CＲ检测Per2－s hＲNA( a～c) 最佳干扰效果片段T ri z ol法提取分别提取细
胞总ＲNA，利用ＲT －P CＲ试剂盒反转录成cDNA
模板，采用real－time P CＲ扩增得到所需靶基因。
反应条件: 50℃2min; 95℃10s，然后按下述条件
进行循环: 95℃15s; 56℃30s; 72℃30s，40个循环。利用SYBＲGreen荧光染料定量检测各组Per2基因的mＲNA表达水平。
Q－P CＲ引物由上海生工生物公司设计并合成，序列如下: Per2: fo r w ard5’－CCC T GG T G T CT G GGA AGA T －3＇，re v erse5’－GGA GG T GAA A CT G T G GAA C A－3＇; β－actin g: fo r w ard5’－T GA C G T GGA C A T CC G C AA AG－3＇，re v erse 5’－ CT G GAA GG T GGA C AG C GA GG－3＇。
1〃2〃7Wetern－blot提取各组细胞总蛋白取总蛋白50μg，经SDS －PAGE电泳、转膜、目的蛋白一抗( 4℃过夜) 、相应二抗(室温2h) 孵育后，用化学发光法显分析目的蛋白的表达情况，以β－actin蛋白表达情况作为上样量标准。运用Gel－Pr o anal yz er进行条带灰度分析，以Per2/ β－actin表示目的基因的相对表达水平。
1〃3统计学分析数据以均数±标准差( x珋±s) 表示，采用S P SS 11〃0统计软件分析，两均数间比较行t检验，P≤0〃05为差异具有统计学意义。
2结果
2〃1Per2－s hＲNA－GV112载体构建及鉴定将双酶切后的病毒质粒载体GV112( 图1) 与
合成的s hＲNA相连接得到重组质粒，将此连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布含有氨苄霉素的LB 固体培养基。挑取单克隆菌落接种到LB 培养液，37℃过夜摇菌后，对菌落载体行P CＲ扩增检测，得到连有s hＲNA片段的阳性克隆P CＲ片段大小为379bp，空载体则为307bp( 图2) 。经生物公司测序鉴定( 表2 ) ，3个靶向Per2基因的重组质粒与设计的干扰片段完全一致，表明3个GV112－Per2－s hＲNA病毒载体构建成功。
图1 G V112 病毒质粒载体图谱
1：阴性对照( ddH2O);2：空载体对照(307 bp);M:M aker;伍止渊
3 ～ 5：连接阳性克隆GV112 －Per2 － s hＲNAa － c( 379 bp); 6：连接阴性克隆( 307bp)
图2 G V112 －s hＲNA 阳性菌落ＲT －PCＲ电泳图
·254·
宁夏医科大学学报
36 卷
表 2 靶向 P e r2 基因重组质粒测序片段
质粒片段名称
质粒片段序列
ＲNAi ( a ) cc gg ccACGAGAATGAAATCCGCTActc g a g TAGCGGATTTCATTCTCGT gg ttttt g ＲNAi ( b ) cc ggg cCAGAGTCCAGATACCTTTActc g a g TAAAGGTATCTGGACTCTG g cttttt g ＲNAi ( c ) cc gg ccAAATTGTTTG TTCCAGGATctc g a g ATCCTGGAACAAACAATTT gg ttttt g ＲNAi ( NC )
cc ggg cTTCTCCGAACGTGTCACGTctc g a g AAGAGGCTTGCACAGTGCA g cttttt g
2〃 2 Per2 － s h ＲNA ( a － c 、N C) 病毒载体的滴度 测定
76. 5% ( 图 7) 。
以 4 × 104
个 / 孔的细胞数量接种 96 孔板，分 别感染 Per2 － s h ＲNA ( a － c ) 慢病毒，并给予嘌呤
霉素筛选。依据倍比稀释法，各孔中均加入 90μL 无血清培养基，然后第 1 个孔中加入 10μL 病毒 原液，混 匀，记 为 1E + 1 μL; 从 第 1 孔 中 吸 取 10μL 加入第 2 个孔中，混匀，所得病毒原液为第 1 孔的 1 /10，记为 1E + 0μL; 依次 10 倍稀释至第 8 个孔，所得病毒原液为 第 7 孔 的 1 /10，，记 为
3 讨论
图 7 W es t e r n b l o t 检测 P e r2 蛋白
在 U343 细胞中的表达
1E － 6μL 。病毒滴度 = 活细胞数 / 病毒原液量，分 别计算出 Per2 － s h ＲNA ( a ～ c 、
N C) 各组的最终 病毒滴度为: 6E + 8 T u ·m L － 1 、7E + 8 T u ·m L － 1
、 6E + 8 T u ·m L － 1 、1E + 9 T u ·m L － 1
。 2〃 3 Ｒeal － time P C Ｒ 筛选最佳干扰片段
将 Per2 － s h ＲNA ( a ～ c 、
N C) 病毒( M OI : 2) 感 染 U343 细胞，经嘌呤霉素筛 ( 2〃 7μg · m L － 1 ) 选 后，提取各组细胞总 ＲNA ，逆转录成 cDNA 并行 real － time ＲC Ｒ 检测，见图 3、图 4 ～ 6 ( 封 3 ) 。实 验结果显示，设计的 a ～ c 三组靶点对 Per2 基因 均有不同程度的沉默效果，其中以 a 组靶点的沉 默作用最为显著。而 N C 组靶点对 Per2 基因并没 有干扰作用。最终确定用 a 组靶点进行大量慢病 毒包装，以用于后续实验。
图 3 r ea l － t i m e PC Ｒ 检测 a ～ c 三组靶点的干扰效果
2〃 4 Per2 低表达的 U343 细胞的筛选
用 a 组干扰靶点包装成的病毒 Per2 － s h ＲNA
( a ) ( M OI : 2) 感染 U343 细胞，在第一次换液时加 入嘌呤霉素，使其终浓度为 2〃 7μg · m L － 1
( 致死 剂量) ，经嘌呤霉素筛选 4 代后获得 Per2 低表达 的 U343 细胞。应用 Western － blot 法检测细胞中 Per2 的蛋白表达水平，结 果显示，Per2 － s h ＲNA ( a ) 组 与 N C 组相比表达率为 24% ，抑 制 率 为
hper2 定 位 于 染 体 2q37〃 3，编 码 一 个 由
1246 个氨基酸组成的近日钟元件蛋白［5］，与多种
肿瘤的发生、发展有关［4，6］。在下调 per2 表达的 研究中，我们还检测到了增殖细 胞核抗原 ( P C -
NA ) 表达的上调，再一次验证了 per2、P C NA 与胶 质瘤的分化程度密切相关，提示了生物钟基因 Per2 参 与 并促进了胶质瘤细胞的细胞凋亡
过程［7］。
短发夹状 ＲNA ( s h ＲNA ) 干扰技术( ＲNAi ) ， 是将特异的 s h ＲNA 片段插入到 ＲNA 聚合酶Ⅲ启 动子 U6 或 H1 下游，在细胞内转录形成 s h ＲNA ， 再被 Dicer 酶剪切成 si ＲNA ，从而发挥沉默目的基
因的作用［8］
。慢病毒载体能将目的基因整合到 宿主细胞染体中，可用嘌呤霉素进行筛选而得 到在子代中稳定表达的细胞株［9］
。
本实验设计并合成了 3 条靶向干扰 Per2 基 因的 si ＲNA 序列，与 连有嘌呤霉素抗性基因的 GV112 病毒载体相连接，成功构建了慢病毒，并 经过鉴定，及嘌呤霉素筛选，得到了 Per2 低表达 的 U343 细胞。为后续深入研究和探讨 Per2 基因
秩
在胶质瘤中的作用机制提供了可靠的基础。
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(责任编辑：任义芳)
C o n s t r u c t in g Pe r2 － s hＲNA L e n t iv ir a l and Selec t in g L ow － ex p r essio n
C ell Lin es of Pe r2 w ith Pu r o m yc in
YIN L e i1 ，W A NG C he ngq uan1 ，W A NG Jun1 ，XIA H ec hun2
( 1〃Ningxia M edical Universit y; 2〃Dept〃 of Neurosurger y，the General Hospital of
Ningxia M edical Universit y，Yinchuan750004)
A b s t ract: Ob j ective To construct s hＲNA lentiviral vectors w hich can inter f ere expression of Period2 ( Per2) gene，and t o establish gli om a U343c ell l ines w ith a l ow expression of Per2gene〃M ethod s T hree pairs o f speci f ic h uman Per2gene s hＲNA target sequence w ere designed and synthesi z ed，w hich could link w ith pEN- TＲTM /U6(GV112) lentiviral vector after annealing〃Screening single colonies，then plasm id w ere e xtracted f or P CＲand sequencing〃 T he plasmids w ere trans f ected int o 293T cells，and the viral supernatant w as collect- ed t o detect the titer of viral〃Ｒeal－time P CＲ w as used f or selecting the best jamming ef f ect of the lentivirus infection U343c ells，then getting cell lines w ith a l ow expression of Per2by pur om ycin，Western blot w as used f or detecting the ef f ects of inter f erence〃Ｒes u l t s T he r esults of P CＲa nd D NA s equencing s how ed t hat knock－ dow n of Per2 w as success f ull y constructed w ith inter f erence ef f ects by s hＲNA lentiviral vectors; f ilter out the best sequence f or Inter f erence by real－time P CＲ，then the drug screening method w as used f or the de- termination of viral and the titer w as6〃0×108 T u·m L －1 ; Western b lot v alidated s hＲNA l entiviral i nfection after gli om a U343cells Per2protein expression levels w ere signi f icantl y decreased〃Con cl u si on L entiviral－mediated s hＲNA inter f erence can be ef f ectivel y suppres
sed Per2gene in gli om a U343cells f or f urther in－depth study and research Per2association bet w een gli om a experimental basis〃
K ey w ord s: Per2g ene; s hＲNA; U343c ells; lentiviral
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