小学生创新作文
注释:
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1.如果要加在序列的5‘端,就在酶切位点识别碱基序列(红)的5’端加上相应的碱基(黑),相同如果要在3‘端加保护碱基,就在酶切位点识别碱基序列(红)的3’端加上相应的碱基(黑)。中华民族根本利益所在是2.切割率:正确识别并酶切的效率
3.加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
一般情况下,普通的内切酶只加入两个保护碱基,其内切反应就可以正常进行;而有一类,仅仅只加入两个保护碱基,其内切反应就不能正常进行,这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类,需要加入至少6个保护碱基,常用的HindIII也要三个。添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。
当在引物5’端添加酶切位点时要考虑:
a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点,这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。
b)如果打算PCR 后直接酶切,不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基,不同的酶对于保护碱基的
董时进要求是不同的。如果不设计保护碱基,则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上,这时要注意Taq 酶的选择,若想在目的序列上附加上并不存在的序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。