米老鼠和唐老鸭电影TAIL-PCR的原理及步骤
TAIL-PCR的原理及步骤
热不对称交错PCR( Thermal Asymmetric Interlaced PCR ,简称TAIL-PCR) 是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA 序列的分子生物学技术. 利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以接测序。 草地晚餐
TAIL-PCR 技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计 3 个嵌套的特异性引物(special prime ,简称sp1 ,sp2 ,sp3 ,约20 bp) ,用它们分别和1个具有低Tm 值的短的(14 bp) 随机简并引物(Arbi-trary degenerate prime 简称AD) 相组合,以基因组DNA 作为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物。物。由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR 反应叫做“半特异性PCR”。这种反应会产生3 种不同类型的产物:1) 由特异性引物和简并引物扩增出的产物;
2) 由同一特异性引物扩增出的产物;
我的张爱玲3) 由同一简并引物扩增出的产物。
在TAIL-PCR 反应中,后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。
2.反应步骤
TAIL-PCR 一般分为3 次反应。第1 次PCR 反应由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性反应和12 次热不对称的超级循环构成。通过5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的序列(载体或T2DNA 等) 退火并延伸,提高目标序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上,10 次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火,随后进行12 次TAIL 循环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物:特异性产物( Ⅰ型) 和非特异性产物( Ⅱ型和Ⅲ型) 。第2 次反应则将第一级反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过10 次热不对称的超级循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。第 3 次反应又将第 2 次反应的产物稀释 1 000 倍作为模板,一般设置为普通的
PCR 反应或热不对称的超级循环。通过上述3 次PCR 反应可获得与已知序列邻近的目标序列。
3.引物设计
根据载体的已知序列设计 3 个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物,特异性引物的长度
约20 bp , Tm 一般为58～68 ℃。再按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物,简并引物相对较短,长度为14 bp , Tm 为30～48 ℃。为了增加简并引物与目标序列间退火的可能性,除了3′端的3 个碱基以外,其它位置的碱基包含简并核苷酸。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。如果不能获得满意的扩增结果,则应该在预备实验中重新设计特异性引物或者换用其它的简并引物。在TAIL2PCR 反应中,高特异性循环的退火温度设为65 ℃左右,较低特异性循环的退火温度设为44 ℃,低特异性循环的退火温度设为25～30 ℃。反应体系中,特异性引物的浓度与普通的PCR 相同,简并引物的浓度要高,一般为2. 5～5. 0μmol/ L ,以满足引物的结合效率。
4.实验条件
多数条件下可用下表中的实验条件完成实验
反应文件号循环次数温度设定
第1 次 1 1 94 ℃2 min ,95 ℃1 min
2 5 94 ℃15 s ,6
3 ℃1 min ,72 ℃2 min
3 1 9
4 ℃1
5 s ,30 ℃3 min ,以0. 2 ℃/ s升至72 ℃,72 ℃2 min
4 10 94 ℃
5 s ,44 ℃1 min ,72 ℃2 min
5 12 94 ℃5 s ,63 ℃1 min ,72 ℃2 min
94 ℃5 s ,63 ℃1 min ,72 ℃2 min
94 ℃5 s ,44 ℃1 min ,72 ℃2 min
漂流瓶的故事6 1 72 ℃2 min
会阴侧切术第2 次7 10 94 ℃5 s ,63 ℃1 min ,72 ℃2 min
94 ℃5 s ,63 ℃1 min ,72 ℃2 min
94 ℃5 s ,44 ℃1 min ,72 ℃2 min
6 1 72 ℃2 min
第3 次8 20 94 ℃10 s ,44 ℃1 min ,72 ℃2 min
6 1 72 ℃5 min
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