QPCR引物设计要点

一、设计对象及分析目的

1.分析对象则为设计对象；但具体的实验对象因具体的实验方法而异；

2.表达水平分析（定量）：RNA(mRNA, lncRNA, rRNA, tRNA, miRNA, piRNA);

3.存在分析（定性）：DNA (CHIP-QPCR), RNA (RIP-QPCR);

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4.等位基因拷贝数分析：DNA （LOH）;

5.甲基化分析：重亚硫酸盐转化后的基因组DNA序列（可以假设CpG位点的C全部发生甲基化，或CpG位点的C全部未发生甲基化）；

6.设计模板：序列号或具体的序列（见图1）日本文化

二、设计参数

以在线软件为例：bi.v/tools/primer-blast/

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1.PCR产物的长度（PCR product size）：一般为80-200bp，最好为：90-140 bp（图2）；

急医疗2.引物的退火温度（Primer melting temperatures, TM）：59-60℃，最优为60℃（在实际进行QPCR反应时，TM值为60℃）（图2）；

3.跨外显子（span an exon-exon junction）：其中一条引物落在相邻两个外显子的交界上，

其作用是避免所提取的总RNA污染了基因DNA所造成的假阳性（图3），如果设计模板为基因组DNA（重亚硫酸盐处理的DNA序列）则不需遵守；

4.跨内含子（separated by at least one intron）：正反引物分别落在相邻的两个外显子上，其作用是避免所提取的总RNA污染了基因DNA所造成的假阳性（图3），如果设计模板为基因组DNA（重亚硫酸盐处理的DNA序列）则不需遵守；

5.BLAST检索引物的特异性，根据设计对象的属性选择合适的数据库种类（图4），输入检测样本的种属（图5）；

6.引物的要求：长度为18-26bp，最优为23bp, 引物的GC含量为50-60%，引物中连续出现的相同碱基的数目不超过4（图6）；642系统

7.计算引物TM值的参数：QPCR反应体系中的一价盐离子，二价盐离子，dNTP的浓度和引物的浓度均可影响TM值（图7）；

8.引物尽量不含已知的SNP位点（图8），否则存在出现碱基错配的风险；

本文发布于:2024-09-20 23:27:55，感谢您对本站的认可！

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