实验六 iRNA干扰 GFP 表达实验
【原理】
RNA 沉默是发生在植物（转录后基因沉默或共抑制）、动物（ RNA 干扰， RNAi ）和真菌（消除作用）等真核生物细胞中的的特异性和高效率的 mRNA 降解机制。在哺乳动物细胞中， RNAi 通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。将靶向特定基因的大约 21 碱基长短的双链 siRNAs(small interfering RNAs) ，或者是 45—50-mer 的发夹结构 RNA （ small hairpin RNA, shRNA ）转染到细胞。 shRNA 在细胞内会自动被加工成为 siRNA ，从而引发基因沉默或者表达抑制。通过质粒表达 siRNAs 同样可以抑制特定基因的表达。选用 PolIII 启动子启动编码 shRNA(small hairpin RNA) 的序列。 PolIII 启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成 RNA ，遇到 4—5 个连续的 U 即终止，非常精确。当这种带有 PolIII 启动子和 shRNA 编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达 siRNA 的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。 【试剂与仪器】
1 ．小牛血清。
2 ．双抗溶液（链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位）。
3 ． DMEM 培养基。
4 ．转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。
5 ．细胞培养基（ DMEM+10%NCS ）。
6 ． PBS 。
7 ．无血清培养基。
8 ．胰酶（ Trypsin ）。
9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜，连续光谱荧光酶标仪。
【操作步骤】
1. 寡核苷酸单链的设计及合成
采用 Ambion 公司的 siRNA Target Finder （online target finder ）进行 siRNA 的设计（www.ambion/techlib/misc/siRNA_finder.html ），公司合成。
siRNA Target Sequence ONE: 5 '- AAGGTGATGCTACATACGGAA -3 '
Sense siRNA strand: 5 '- GGUGAUGCUACAUACGGAAtt -3'
Antisense siRNA strand: 3' - UUCCGUAUGUAGCAUCACCtt -5'
Position in gene sequence (cDNA): 104
Top Strand Oligonucleotide Template: (59mer)
5'- C GGTGATGCTACATACGGAA TTCAAGAGA TTCCGTATGTAGCATCACC TT TTTTGGTAC -3'
Bottom Strand Oligonucleotide Template: (59mer)
5'- CAAAA AAGGTGATGCTACATACGGAA TCTCTTGAA TTCCGTATGTAGCATCACC GGGCC -3'油纸电容式套管
2 ． shDNA 的退火
用无核酶水稀释合成的单链寡核苷酸至 200μmol/L
反应体系组成：
Top strand DNA oligo ( R ) （ 200μmol/L ） 5μl
Bottom strand DNA oligo ( F ) (200μmol/L ) 5μl
北京智能交通网10×Oligo Annealing Buffer 2μl
DNase/RNase free water 8μl
Total volume 20μl
程序退火
95℃ 4min 变性
90℃ 、80℃ 、70℃ 、60℃ 、50℃ 、40℃ 、30℃ 、20℃ 、10℃ 每 10 度递减，依次反应 3min 4℃ 10min
伤怀之美
-20℃ 保存
取 1μl 产物 2% 琼脂糖凝胶电泳，鉴定退火程度。
3 ． U6- shDNA 质粒构建
用 ApaI 和 KpnI 双酶切含人源 U6 启动子的质粒，回收线性质粒（参见实验一步骤 9 ）。
用连接酶将步骤 2 退火片段与线性的载体连接。
在 0.2ml 或 0.5ml 反应管中加入下列成分
线性载体 50ng
shDNA 100ng
河南妇女毛深深的沟WCD
T4 连接酶 2-3weiss units
10× 连接缓冲液 1μl
补超纯水至总体积为 10μl ，常温下放置 30 分钟以上；也可以16℃ 或4℃ 过夜。
4 ．转化细菌筛选阳性重组子（参见实验四）。
5 ．扩增含阳性重组子的细菌，提取质粒，备用。
6 ．转染细胞（参见实验五）。
7 ．荧光显微镜观察 GFP 的表达变化，用荧光酶标仪测荧光强度的变化。
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能 在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
引物设计应注意如下要点：
1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行
反应。
2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现
3 个以上的连续碱基，如
GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3g视频服务器
3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配
效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’
端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的G C含量不能相差太大。
5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软
件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6 ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），
而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行
[8]。
8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
1中国美术学院(中国唯一国家级重点学科所在地，美术学，设计学博士点所在地.联合国承认学历的中国唯一美术类大学.属文化部和浙江省共同直属，教学评估优秀学校) 2中央美术学院(美术学，设计学博士点所在地.教育部直属大学.教学评估优秀学校)
3西安美术学院(美术学博士点所在地，陕西省直属.还未教学评估)
4天津美术学院(天津市直属，教学评估优秀)
5鲁迅美术学院(辽宁省直属，未教学评估)
6广州美术学院(广东省直属，未教学评估)
7湖北美术学院(湖北省直属，教学评估良好)
声带小节8四川美术学院(重庆市直属，教学评估不合格)
附:(中国美术考生心中美术大学排名)
1中央美术学院(油画强，造型学科厉害)
2中国美术学院(国画强，雕塑强.考生多，学校漂亮)
3鲁迅美术学院(素描等造型专业比较牛)
4四川美术学院(油画强，特别罗中立比较有名)
5天津美术学院(无评论)
6广州美术学院(设计强)
7西安美术学院(无评论)
8湖北美术学院(无评论
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议