对于用差异显示或者抑制减法杂交、RNA指纹、EST芯片及兼并引物扩增等方法得到DNA片断，可利用掌中宽带SMART cDNA Amplification技术克隆全长cDNA，引物设计方法如下：
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（一）如欲克隆的基因在GenBank已列出的26种生物中，且是多基因家族的一个成员，应先上网进行BLAST(bi.v/BLAST)，为了提高扩增的特异性，应选择没有同源性的区域设计引物。
（二）基因特异性引物（gene special primer，GSP）和巢式引物 (nested primer，NP)的设计方法：淮海医药网
1）5′RACE引物设计
将UPM序列（45bp）加在已知部分序列的5′端并设定为上游引物，在序列的5′端附近寻合适的片端选作下游引物GSP1。将NUP序列（23bp）加在已知部分序列的5′端并设定为上游引物，在序列的5′端附近寻合适的片端选作下游NP引物NP1。用oligo 6.0软件分析引物。 2）3′RACE引物设计
将UPM反向互补序列（博思清45bp）加在已知部分序列的3′端，并设定为下游引物，在序列的3′端附近寻合适的片端选作上游序列GSP2。将NUP反向互补序列（23bp）加在已知部分序列的3′端并设定为下游引物，在序列的3′端附近寻合适的片端选作上游安阳工学院学报NP引物NP2。用oligo 6.0软件分析引物。
（三） 3′和5′RACE引物设计原则：
1）引物长度：以23~28个碱基为宜，最好不超过30个碱基；
2）GC含量为50%~70%什么是宪法；
3）Tm最好＞70℃，至少≥65℃（用软件或经验公式提供的退火温度只是一个参考值，在具体操作中要灵活多变）；
4）GSP的5’端6个碱基与UPM两条引物的3’端互补碱基应＜4，NP的5’端6个碱基与NUP的3’端的互补碱基应＜4；
5）NP不能与GSP重叠；
6）3′和5′RACE扩增产物最好有重叠部分，以便全序列的拼接。(实际运用中是否真的要存在重叠部分，因为片段是已知的，以及race引物和巢式引物设计的位置怎么定，race引物在外？巢式引物在内？还是？)
（四） 如果是多基因家族的，且已知的信息有限，RACE的产物可能出现多条带，可先将电泳后胶上的条带转到尼龙膜上，在EST序列中克隆一DNA片段，用32P-dCTP标记，Southern印迹法，即可鉴定出来。（因为是把片段切下来做的，那么就是以该片段作为唯一模板，为什么race还会出现多条带？难道多基因家族有可能存在分子量一致的情况？）
用的试剂盒
引物设计的具体注意事项
Oligo dG 后面的10是什么意思？十个G？adaptor primer是现成的还是自己设计的？
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