神洁巾
王颖;鲁丹丹;张玉林;高婵;李树;王升启
【摘 要】An ion-pair reversed phase LC method (IP-RPLC) was developed for the analysis of related substances of a phosphorothioate antisense oligonucleotide flutide and routine quality control. The analytical result of IP-RPLC was compared with ion exchange chromatography (IEC) and capillary gel electrophoresis (CGE). The synthesized flutide and its analogs of monphosphodiester 5'(P=O)1 as well as deletion sequences 5'n-1 and 3'n-1 were analyzed. The optimized conditions of IP-RPLC were as follows: Xterra MS C18(250 mm × 4. 6 mm, 3. 5 μm) column; the mobile phase A was 142 mmol/L 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP)-36 mmol/L triethylamine acetate (TEA)-10% methanol (V/V), the mobile phase B was methanol; the gradient from 0 to 20% of solution B in 35 min, then back to 0% in 2 min, equilibrated 8 min; column temperature: 50 ℃ ; flow rate of mobile phase: 0. 5 mL/min; detection wavelength; 260 nm. The result showed that under these conditions, flutide, deletion sequences 5'n - 1 and 3'n-1 could be completely separated from
each other and the resolution R of flutide and 5'(P=O)1 could reach to 0. 94. The proposed IP-RPLC method has been applied for the related substances analysis and identification of crude and purified flu-tide samples, indicating that this method can be used for the quality control of phosphorothioate anti-sense oligonucleotide.%建立了离子对反相液相谱(IP-RPLC)分析流感泰得(Flutide)有关物质的方法,并将其与其它两种常用方法(离子交换谱(IEC)和毛细管凝胶电泳(CGE)法)的分析结果进行比较.合成了Flutide及其单核苷酸缩短序列5’n-1、3’n-1和单氧代序列5’(P=O)1,将它们作为已知杂质,在IP-RPLC上进行分离条件的优化,使用的分析柱为XTerra MS C18柱(250 mm× 4.6 mm,3.5 μm)；流动相A为142 mmol/L HFIP-36 mmol/L TEA-10％甲醇(V/V),流动相B为甲醇；梯度洗脱；流速为0.5 mL/min；柱温为50℃；检测波长为260 nm.结果表明,在该条件下,Flutide能同时与这几种杂质进行分离,其中与缩短序列5’n-1和3’n-1可实现基线分离,而与5’(P=O)1之间的分离度也能达到0.94.所建立的IP-RPLC方法已成功应用于Flutide粗品和纯品中各类杂质的分析和鉴定. 【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】林静珊2011(039)012
zo0sko0icom性
【总页数】6页(P1811-1816)
【关键词】离子对反相液相谱;硫代反义寡核苷酸;流感泰得;质量控制;杂质
【作 者】王颖;鲁丹丹;张玉林;高婵;李树;王升启
【作者单位】安徽医科大学,合肥230032;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850
【正文语种】中 文
随着生物技术市场的发展，反义寡核苷酸药物得到了广泛的应用，尤其是硫代反义寡核苷酸(PSODN)，通过对核酸骨架中非桥键氧原子的硫代修饰，增加了对核酸酶的稳定性，提高了反义活性，并且显示了良好的药代动力学性质，具有广阔的药学应用前景［1～4］。尽管寡核苷酸自动合成是一个高效率过程，但每一步仍会产生少量杂质。据报道［5］，人工合成硫代寡核苷酸的杂质主要包括缺失核苷酸的缩短序列(n-x)和少量硫代不完全序列(P
=O)x。这些杂质常用的分析方法主要为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、毛细管电泳(CE)和离子交换谱(IEC)等［6］。近年来，离子对反相液相谱(IP-RPLC)通过与质谱的联用，已成为核酸药物质量控制和体内外代谢产物研究的重要分析手段［7，8］。
流感泰得(Flutide)是本实验室筛选获得的一条以流感病毒基因组RNA的5'非编码区(UTR)为靶、全长13个碱基的硫代修饰反义寡核苷酸药物，体内外药效学评价研究证明其具有较好的抗病毒活性［9］。为了对该反义核酸药物进行质量控制，本研究建立了一种改进的IP-RPLC方法，采用HFIP/TEA作为离子对试剂，并对离子对试剂浓度和洗脱梯度等条件进行了系统优化，获得了同时分离Flutide全长序列(n)与缩短序列杂质5'n-1，3'n-1，以及单氧代序列杂质5'(P=O)1的分析条件，并采用电喷雾质谱(ESI-MS)进行了结构确认。同IEC和CGE比较，该方法提供了更好的分离选择性，且操作更为便捷。该方法已成功应用于Flutide粗品和纯品的杂质分析。
2.1 仪器与试剂
三乙胺(TEA，纯度99.5%)、1，1，1，6，6，6-六氟异丙醇(HFIP，纯度＞99%)、甲醇(MeOH，纯度99.9%)和乙腈(ACN，纯度99.9%)均购自Sigma-Aldrich公司;Milli-Q纯水(18
MΩcm-1)纯化自Milli-Q系统(美国Millipore公司);乙二胺四乙基(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、NH4 Cl等为国产分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)。
Flutide是长度为 13个碱基的硫代修饰寡核苷酸(序列为 5'-CCTTGTTTCTACT-3')，采用ÄKTApiloⅡ核酸合成仪(美国GE Healthcare公司)进行合成，制备液相谱纯化，超滤脱盐，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到。缩短序列5'n-1 5'-CTTGTTTCTACT-3'、缩短序列3'n-1 5'-CCTTGTTTCTAC-3'和单氧代序列5'(P=O)1 5'-COCTTGTTTCTACT-3'(序列中标有O的位置表示氧代)的合成和纯化方法同上。
2.2 实验方法
木兰花张先2.2.1 IP-RPLC的谱条件 2695液相谱系统，996二极管阵列检测器(美国Waters公司);分析柱为XTerra MSC18柱(250mm×4.6 mm，3.5μm，美国Waters公司)。样品浓度为200μmol/L，取10μL进样。流动相A为142mmol/L HFIP-36mmol/L TEA-10%甲醇(V/V)，流动相B为甲醇;梯度洗脱:0～35 min，0%～20%B;35～37 min，20%～0%B，平衡8 min;流速0.5 mL/min;柱温50℃;检测波长为260 nm。考察结果以分离度(R=2(t R2-t R1)/(w1+w2))作为标准评价，其中，t R1和t R2分别代表前后两个谱峰的保留时间，w1和w2为各自的
峰宽。
2.2.2 IEC的谱条件 600液相谱系统，2487双波长紫外可见检测器(美国Waters公司);分析柱为DNAPac PA-100柱(250 mm×4 mm，5μm，美国Dionex公司);流动相A为1 mmol/L EDTA-25 mmol/L Tris-10%乙腈(V/V)，流动相B为1 mmol/L EDTA-25 mmol/L Tris-3.0 mol/L NH4 Cl-10%乙腈(V/V);梯度洗脱:0～30 min，10% ～70%B;30～31 min，70% ～100%B;31～36 min，100%B;36～41 min，100%～10%B。流动相均用Mill-Q水配制并用0.45μm滤膜过滤;流速为1 mL/min。柱温50℃;检测波长为260 nm;分析软件为Millenium32。
2.2.3 CGE的分析条件 P/ACE MDQ毛细管电泳系统(美国Beckman公司);eCAPTM DNA毛细管、eCAPTM ssDNA 100-R胶，Tris-硼酸和尿素缓冲液干粉。缓冲溶液为Tris-硼酸-7 mol/L尿素，pH 8.5;分离胶为250 g/L ssDNA 100-R凝胶，分离电压为-15.5 kV;分离温度为40℃;采用电动进样，进样电压-10 kV;检测波长为254 nm;分析软件为Beckman P/ACE system MDQ version 2.3。
2.2.4 ESI-MS的分析条件 质谱采用TSQ7000电喷雾质谱仪(美国Thermo公司)，操作系统
为Xcalibur，采用美国Agilent HPLC1100分离，样品经反相C18柱脱盐后，取100μL直接进样分析;毛细管电压3.5 kV;射频透镜电压0.5 V;离子源温度分别为180℃;离子源内真空度4.6×0-6 Pa，注射泵的流速为2μL/min，采用负离子扫描模式，扫描范围500～3000 U;数据分析软件为Promass。
南京栖霞区疫情3.1 IP-RPLC分析条件的建立和优化
3.1.1 流动相优化 作为实际药物使用的单链寡核苷酸多由不同碱基排列组合而成的序列，因碱基组成不同带来的样品特殊性给分析和质量控制增加了难度［10］。IP-RPLC法的分离主要基于不同长度寡核苷酸的带电量和疏水性。最常用的离子对试剂为醋酸三乙胺(TEAA)，然而TEAA对于长度大于25 mer的序列，分离全长序列(n)和失去一个碱基的缩短序列(n-1)效果较差［11］，并且由于硫代修饰后产生数个手性中心，导致峰展宽严重，因此该试剂主要用于未修饰的寡核苷酸。此外，TEAA和质谱联用时还容易产生离子抑制［12］，不适用于后续的质谱鉴定分析。2001年，Apffer等［13］提出的HFIP能消除非对应异构体的影响，且与质谱兼容性好，离子化效率高，HFIP-TEA离子对试剂已成功运用于LC-MS联用分析寡核苷酸及其代谢产物［14］。
本实验选用XTerra MS C18柱，考察了不同浓度HFIP-TEA离子对试剂条件下Flutide的5'n-1，3'n-1杂质与n的分离度。研究发现，HFIP浓度在100～142 mmol/L范围内、提高TEA的浓度时，3种化合物之间的分离度均有提高。然而，继续增加HFIP和TEA的比例时，分离度反而下降。当HFIP浓度为142 mmol/L，加入36或43 mmol/L的TEA时，分离度最好，但后者在流动相配制时，TEA很难完全溶解，需搅拌很长时间，同时pH值升高。本实验最终选择142 mmol/L HFIP-36 mmol/L TEA作为流动相，具体分析结果见表1和图1。
杜华瑾同时还考察了相应浓度下5'n-1与5'(P=O)1及n之间的分离度。发现HFIP在低浓度时，随着TEA浓度的升高，三者之间的分离度增加，142 mmol/L HFIP-36 mmol/L TEA时达到最大，R5'n-1，n=1.72，R5'n-1，5'(P=O)1=0.63，R5'(P=O)1，n=0.94;继续增加HFIP和TEA的浓度，三者分离度均下降(图2)。由于不完全硫代序列存在非对映异构体，IP-RPLC法对(P=O)x杂质的分离较难达到基线分离。只有一个氧原子未被硫代的5'(P=O)1与n之间的疏水性极为相似，谱保留行为接近，故两者在反相谱柱上的分离度有限。
Flutide(13个碱基)中5'(P=O)1杂质与n的分离比反义核酸药物Cantide(20个碱基)［15］中5'(P=O)1杂质与n差，与以往认为的序列越短分离度越好的结论不同。推测可能因为在一定
序列长度范围内，碱基组成对序列谱保留行为的影响大于序列长度对保留行为的影响，不同碱基组成的序列对方法专一性要求较高。
3.1.2 流速对分离度的影响 采用142 mmol/L HFIP-36 mmol/L TEA配比的流动相，考察了流速对分离度的影响。本实验以分离度R为指标，分别考察了0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL/min流速下全长序列n与缩短序列5'n-1和3'n-1各自之间的分离度结果见表2。流速为0.4mL/min时，R3'n-1，5'n-1达到最大;流速为0.6mL/min时，R5'n-1～n达到最大。另外考察了中间流速0.5mL/min时分离度与0.6 mL/min时相当，此时R3'n-1，5'n-1为1.312，R5'n-1，n为1.897，3'n-1，5'n-1和n三者间接近于基线分离。
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