双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) 【技术背景】 目前检测HBsAg的技术有:①两位点一步法:可出现钩状效应,待测抗原浓度过高出现假低值或假阴性;②两步法:无钩状效应;③一步半法:减少钩状效应。 本实验所采用的方法为一步半法,此法是基于抗原抗体特异性反应的原理,因此对于所检测的抗原其对应的抗体是特异性的,待测抗原必须存在于抗体结合的抗原决定簇,因此,此法用于乙肝表面抗原是比较准确的。
【病人准备】
虽然在进行乙肝表面抗原检查前没有空腹检查的要求,但检查前一天应注意不喝酒、不服用任何对检测结果有影响的药物。
【标本的采集与保存】
血清:采用正确医用技术采集静脉血2ml,待血液自然完全凝固后,2000-3000转/分离心10分钟,取新鲜血清用于检测。 盾构机过站
限流熔断器血浆:用抗凝血浆管(枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一作抗凝剂)采集静脉血2ml, 3000-3500转/分离心10分钟,取新鲜血浆用于检测。
血清样品:5天内测定,可以放置于4℃;超过一周,-80℃保存
2.实验前准备
1)用前三十分钟从冰箱中取出的试剂盒和待测标本,平衡至室温(18-25℃);
2)将恒温箱或恒温水箱调至反应温度。
【原理】
将抗HBs 的单克隆抗体(简称单抗)或多克隆抗体(简称多抗)包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体上,加人待测血清和酶标记抗体(抗HBs-HRP),血清中HBsAg与微孔板上的包被抗体(抗HBs)结合,洗涤分离后,加人酶底物系统,留在微孔板表面抗HBs-HBsAg-抗HBs-HRP复合物中的HRP催化底物进行显反应。根据显反应颜的深浅(吸光度A 高低)与血清标本中HBsAg含量成正相关,以此判定血清样品中HBsAg 的有无及相对含量。显为阳性,不显为阴性。
【试剂与器材】
1.试剂抗HBs包被的微孔板、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、酶标试剂、浓缩洗涤液、显剂A、显剂B、终止剂、封板膜
2.器材加样(20μL、50μL -250μL)、恒温设备(恒温水浴箱或恒温箱)、洗板机、酶标仪、吸水纸、消毒缸
要求:a )酶标仪在450 nm 和492 nm 的波长不精密度应在≤1 %,分别在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之间,吸光度(A 值)要求可以测到小数点后两位;
内蒙古大学图书馆中国河流警钟长鸣b )移液系统在100μl和50 μl 的移液不精密度应≤1 % ,分别在99- 101μL和
49.5μL-50.5μL 之间;
c )恒温系统在37 ℃、43℃的温度变异应成±1℃。
【操作方法】
1.编号
吴君玉
将微孔板按序编号。每批实验应设阴性对照3孔、阳性对照2孔、空白对照1孔,其余为待测血清孔(3孔)。
2.加样品稀释液:每孔加入样品稀释液20μL或一滴,空白孔不加。
3.加样:在待测血清孔、阴性对照孔和阳性对照孔中加入相应血清100μL/孔。轻轻振荡混匀。
4.温育:用封板膜封板后,置37℃温育60min。
5.加酶标物:小心揭掉封板膜,每孔加入酶标试剂50μL或1滴,空白孔不加。轻轻振荡混匀。
6.温育:用封板膜封板后,置37℃温育30min。
7.将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水或去离子水稀释20倍后备用。
8.洗板:小心揭掉封板膜,手工洗涤5次,每次都要在吸水纸上尽量拍干或用洗板机洗涤5次,最后一次尽量扣干。
9.显:每孔加显剂A和显剂B各50μL或1滴,轻轻振荡混匀,37℃避光显30min。
10.比测定:每孔加终止剂50μL,轻轻振荡混匀,设定酶标仪主波长为450nm,次波长630nm,10min内测定各孔吸光度(A)值
【结果判定】
1.临界值Cut off(CO)的计算:CO = 阴性对照孔A均值×
2.1 (阴性对照孔A值低于0.05者,按0.05,高于0.05按实际A值计算计算) msn explorer
2.计算S / CO比值(S为样品A值)
3.阳性结果:样品A值≥CO值或S / CO ≥ 1为HBsAg阳性
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