中国兽医科学 2020,50(12): 1572-1579
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-09-11 D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2020.0185 中图分类号：S852.659.5 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2020)12-1572-08
潘亮奇，李硕，吴梅花，于亚南，林嘉特，孙华鹏，崔新鑫，许丰祥，
刘杨，李明亮，焦培荣，廖明，孙海亮*
(华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业农村部人畜共患病重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642)
摘要：禽流感在世界范围内不断暴发，不但给养禽业造成了巨大的经济损失，而且给公共卫生安全造成了一定威胁。当前，疫苗免疫仍然是预防与控制禽流感的主要手段。而纳米疫苗具有免疫剂量小、效应时间 长、定点靶向性、生物相容性好等特点，因此寻求和开发新型纳米疫苗用于防控禽流感具有很强的现实意义。本文从纳米疫苗的种类、疫苗抗原的类型、免疫接种途径以及应用前景方面，对禽流感纳米颗粒疫苗的研究进展进行论述，以期为新型禽流感纳米疫苗的研发提供参考。 关键词：禽流感；纳米疫苗的种类；疫苗抗原的类型；免疫接种途径
Research progress of avian influenza nanoparticle vaccine
PAN Liang-qi,LI Shuo,WU Mei-hua,YU Ya-nan,LIN Jia-te,SUN Hua-peng,CUI Xin-xin, XU Feng-xiang, LIU Yang, LI Ming-liangJIAO Pei-rong, LIAO Ming, SUN Hai-liang* (College o f Veterinary Medicine y South China A gricultural University/Nalional and Regional Joint Engineering Lai) o ratory f or
Medicament o f Z oonoses Prevention and Control/Key Laboratory o f Z oonoses , Ministry o f A griculture/Key Laboratory f or Prevention and Control o f Z oonotic Diseases o f Guangdong Province , Guangzhou510642, China)
Abstract：Avian influenza continues to outbreak around the world,not only cause huge economic losses to the poultry industry,but also pose certain th reat to public health. C urrently, immunization is s t i l l the main way for prevention and control of avian influenza. Nanoparticle vaccines show many good features,such as small immunization dose,long e ffect time,targeting,and good biocompatibility. T h erefo re,it is s ig n ific a n t to seek and develop novel nanoparticle vaccines for prevention and control of avian influenza. Development of avian influenza nanoparticle vaccines is discussed in th is review including nanoparticle vaccine ty p es，vaccine antigen types,immunization methods and app
十大自然灾害发布lication prospects. I t is expected to provide new ideas for the fu rth er development of novel avian influenza nanoparticle vaccines.
Key words：avian influ en za;sty les of nano p a rtic le vaccines;types of antigens；immunization methods
* Corresponding author：S U N Hai-liang,E-mail ：*************；Tel：************
禽流感是一种由甲型流感病毒引起的禽类高吸道症状为主要临床症状。禽流感病毒(AIV)易发发性疾病，以精神沉郁，食欲减退，咳嗽、喷嚏等呼生变异和重组，H5亚型A IV基因型已经出现多种 收稿日期：2020-08-07；修回日期：2020-08-24
基金项目：国家自然科学基金项目（31830097)；广东省自然科学基金面上项目（2018A0303130092)
作者简介：潘亮奇（1994-)，男，江西宜春人，硕士生，研究方向为流感病毒疫苗的研制，E-mail :2444900366@qc!. com。*通讯 作者：孙海亮（1980-)，男，山东潍坊人，副教授，主要从事动物传染病的研究，E-mail :hsun@scau. edu. c n，T el:
************〇
第12期潘亮奇等：禽流感纳米颗粒疫苗的研究进展1573
离r 凝胶法
离子凝胶法
¥
分裂和亚替代1:。禽流感可分为高致病性禽流感与 低致病性禽流感，高致病性禽流感往往会造成禽类 的大规模死亡，而低致病性禽流感一般不会引起禽 类死亡。高致病性禽流感在世界多个地方时常暴 发。据O I E 报道，近几年我国也接连发生高致 病性禽流感（见表1)，给养禽业造成了巨大的经济 损失。疫苗接种仍然是当前预防和控制禽流感的主 要手段。传统禽流感疫苗一般分为三种，灭活疫苗、
弱毒活疫苗和基因T .程疫苗。传统疫苗存在一定的 局限性，如减毒活疫苗可能出现“毒力返祖”的情 况，灭活疫苗产生免疫力持续时间短，质粒D N A 疫 苗可能整合到免疫动物染体，免疫应激反应大 等。在全球禽流感疫情不断暴发的挑战下，养禽业 急需一种高效、低毒、免疫原性好、适用范围广的疫 苗来摆脱闲境。
表1我国高致病性禽流感流行情况
Table 1 Epidemic situation of highly pathogenic avian influenza in china
暴发时间
Time of outbreak 省份
Provinces
亚型
Subtypes 疫情数
Number of outbreaks
发病数
Number of diseases
2019-03-26辽宁 Liaoning H5N11 00025 4722019-02-13云南Yunnan H5N646356 3802019-05-24新賴 Xinjiang H5N61 50311 9102019-12-29新璐 Xinjiang H5N69752020-01-24湖南Hunan H5N1 4 5007 8502020-01-02新概 Xinjiang H5N66752020-01-09新璐 Xinjiang H5N611502020-02-02西藏历史
四川 Sichuan
H5N6
1 840
2 497
纳米颗粒是指粒子直径大小在1〜100 n m 之间 的微小颗粒。因其物理、化学和生物学的特性，使其 广泛应用到食品、化工、检测、纺织与机械、生物医 学等方面。纳米颗粒经过精密加工，不仅能够被设 计成病毒自然的形态（病毒样颗粒），还能够同时装广阔。纳米颗粒可以通过物理、化学和生物合成等 方法获取'不同合成方式获得的纳米颗粒在细胞 融合和抗原装载方式等方面存在一定的差异。目前 禽流感纳米疫苗的制备方法主要有三种：自组装法、 乳化交联法以及离子凝胶法，三种方法的一般流程混合液
载多种抗原，因此纳米颗粒在疫苗方面的应用前景
见图1。
mRNA/RNA
蛋白质
自组装法乳化交联法
在细菌/细胞体内自 组装形成自组装/病_ 毒样纳米疫苗
\ <
<
原料\
油/水相
油/水相
¥
河南油田高级中学19
原料溶液
原
料溶液
抗
原
图1禽流感纳米疫苗的制备流程
Figure 1
Simple diagram of the preparation process of avian influenza nano-vaccine
1574中国兽医科学第50卷
近几年禽流感纳米疫苗发展迅速，进行了大量富有成效的探索实验（见表2)。纳米疫苗缓释能力强、
免疫效应时间长、具有定点靶向性、生物相容性好、免疫效果好，能够解决传统疫苗所带来的风险问题，具有良好的应用前景。本文将从纳米颗粒种类、抗原类型、接种途径和应用前景方面，阐述禽流感纳米颗粒疫苗的发展历程，促进人们对流感纳米疫苗的了解。
表2近几年禽流感纳米颗粒疫苗研究情况
Table 2 Research status of avian influenza nanoparticle vaccine in recent years
疫苗类型
V a c c i n e types
粒径/n m
Particle d i a m e t e r
抗原类型
A n t i g e n types
时间
T i m e
参考文献
R e f e r e n c e s
V L P s80〜120H A、N A和M蛋白2008[3] V L P s40〜1%H A和M2蛋白2020[4]自组装蛋A颗粒-H A和铁蛋白2013[5]聚合物颗粒-M2e2011[6]聚合物颗粒-M2、H A2和 C T A12017[7]聚合物颗粒164C p G O D N 20072020[8]聚合物颗粒-H A2020[9]无机颗粒18质粒2012[l〇]无机颗粒-m A b-H A2017[11]
-表示文献中没有报道出具体的粒径大小。
-Indicates that the specific particle size has not been reported in the literature.
l纳米颗粒的种类
i.i病毒样颗粒
病毒样颗粒(V L P s)是指含有病毒的一个或多个外膜蛋白的结构，内核中没有病毒的遗传物质，直径大小为20〜150 n m的微小颗粒。病毒样颗粒又称“假病毒”、“类病毒”，在形态上类似于病毒的蛋白颗
粒。禽流感病毒V L P s疫苗可分为三种形式：单亚型V L P s疫苗、多亚型V L P s疫苗、嵌合型V L P s 疫苗[12]。V L P s可作为禽流感疫苗的递送平台，多种 病毒株都能够制备出V L P s，包括H1N1，H3N2, H5N1,H9N2 和 H7N9[13’。将 H5N3 毒株的 H A 和 N A蛋白连同H7N1毒株的M蛋白制备成病毒样颗粒(V L P s)，免疫S P F番鸭后，能诱导鸭体产生一定水平的抗体3]。用H5N1毒株制备的病毒样颗粒疫苗，首次免疫就能够诱导高水平的H丨和N I抗体，并 保护鸡免受野生型H5N1病毒的攻击最近，利 用烟草作为“生物反应器”制备的V L P s，免疫SPF 鸡，能刺激机体产生高水平的H1抗体，有效减少病毒的排毒量[4]。N D V与A I V嵌合V L P s能够体外激活D C细胞，诱导有效的免疫刺激，增强s l g A的分 泌和脾脏T细胞的分化％。现如今禽流感V L P s的 大规模生产一般包括以下几个流程：禽流感病毒结构基因设计与表达、宿主表达系统的选择、纯化、鉴 定、大规模生产、包装等。当前，禽流感V L P s生产还存在产量较小，下游加T：不能满足高回收率和生产率/纯度的要求等生物加工问题18]。另外，禽流感V LPs的功能化处理还存在一定的技术难题，亟待技 术的快速升级。
1.2自组装蛋白纳米颗粒
自组装蛋白纳米颗粒是一种蛋白质聚集成团的结构，利用非共价键相互作用，让数百个相同的多肽或小蛋白亚基聚集成一个对称的空间结构[1!U0]，将 靶向抗原很好地包埋在粒子中[21]。当前，研究较多的 自组装蛋白包括病毒颗粒（virus particles)、血清白蛋白（serum albumin )、丝蛋白（silk protein)及铁蛋白(ferritin)[22]。利用蛋白质结构的特殊性，设计出自组装纳米颗粒。与传统流感疫苗相
比，用自组装蛋白纳米疫苗免疫后，可以引发更广泛，更有效的免疫保护力，所诱导的血凝抑制抗体滴度是商业灭活疫苗的10倍以上[5]。利用H1亚型流感病毒的H A茎部制备 的H l-S S-n p疫苗，免疫小鼠和雪貂后，能够诱导产生广泛的交叉抗体，并且能够抵御异型流感病毒的感染[23]。自组装蛋白纳米疫苗存在脱靶免疫反应，这 可能会限制后续的加强免疫或其他疫苗的接种，所 以自组装蛋白纳米疫苗暂时还不能作为通用禽流感疫苗[21]。最近，有学者研制出C ap-3M2e自组装 V L P，它是一种经济且应用前景较好的二联纳米疫苗，可提供针对IAV和PC V2的双重保护_。因此，多联疫苗可能是未来研究的热点。
电气控制柜第12期潘亮奇等：禽流感纳米颗粒疫苗的研究进展1575
1.3聚合物纳米颗粒
聚合物纳米颗粒，具有多种形态结构，尺寸通常为10〜1 000 m n。与低分子量自组装脂质体不同，聚合体通常由各种结构的两亲性物质制备，两亲性物质包括两亲性二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、接 枝共聚物和树枝状共聚物[25]。聚合物纳米疫苗的抗原可以通过物理包埋或者化学键的方式结合到聚合物纳米颗粒中。聚合物纳米颗粒因为能够容纳不同的药物或抗原，已被广泛应用于药物传递和疫苗开发[21]。近几年，生物降解纳米材料发展迅速。将真核质粒p C A G G S-opti-44卜H A与树枝状聚赖氨酸(D G L)融合制备的重组质粒p C A G G S-〇pti44卜H A/ D G L[26\将M2、H A2和毒素亚基A1
融合蛋白装配到聚g-谷氨酸（g-P G A)-壳聚糖中制备的疫苗[7]以及四聚体疫苗（Tetra-M2e)[6]，均能够诱导较强的体液免疫反应，并显著提高特异性细胞免疫的水平。聚合物纳米颗粒疫苗通过鼻内途径给药时，存在一定的安全问题，材料可能通过嗅觉连接转移到中枢神经系统，进而可能产生未知后果[21]。
1.4无机纳米颗粒
无机纳米颗粒是指颗粒的组成成分是纳米级的无机物质，粒径在1〜1 000 n m之间，组成成分包括无机物质（主要是A U m、A g W等金属）和磁性物质（Fe304[28])等。现阶段，无机纳米颗粒技术主要应用于禽流感病毒的检测与分离，例如数字单病毒免疫测定法[29]、八11阶5检测H9N2亚型的方法#和数 字化单病毒电化学酶联免疫分析法[31]。在疫苗研制方面，无机纳米颗粒发展比较慢，仅有寥寥几个较为成功的成果产生。如：利用H5N1质粒制备的银纳米颗粒疫苗（A g N P)，平均粒径为11 n m，口服免疫途径能够诱导抗体和细胞介导的免疫反应，并能够促进细胞因子的产生。但银纳米颗粒(A g N P)有潜在 的生物相容性问题，还需要进一步通过动物实验进行验证同时，A g N P还具有一定的细胞毒性，可 能与活性氧(R O S)有关[32]。
2疫苗抗原类型
吴阶平简介2.1灭活病毒
以灭活病毒为免疫原的纳米疫苗称为灭活纳米疫苗，通常用于黏膜抗原的递送系统，用来预防与控制多种疾病;33]，例如：新型冠状病毒灭活纳米疫苗夂351、禽流感病毒灭活纳米疫苗〜37、猪流感病毒灭活纳米疫苗w和猪圆环病毒灭活纳米疫苗[39]等。这种纳米疫苗能够激活抗原递呈细胞(A P C)对 颗粒的吸收，从而刺激B细胞的增殖与分化，使B 细胞转换为特异性浆细胞以产生IgA 5]。与传统灭活疫苗相比，灭活病毒纳米疫苗具有诸多优点：如血 清和泪液中含有高浓度的血凝抑制抗体™，能诱导高水平的中和抗体：能够经多种免疫接种方式递送，等等。例如，喷雾免疫可激活吞噬细胞，促进7 干扰素和白介素-6的产生，从而增强细胞介导的免疫反应[42]。多数灭活病毒纳米颗粒疫苗通过肌内，皮下或皮内注射方式实施免疫™，少量通过鼻内或者喷雾免疫。
2.2核酸
DNA疫苗具有“抗原储藏器”的作用，在没有加强免疫的情况下，能够连续不断地产生蛋白产物以刺激免疫系统％。当前，质粒、mRNA这两种核酸纳米疫苗研究较多。禽流感DNA疫苗主要包括H A疫 苗、N A疫苗以及N P疫苗，其中H A疫苗和N A疫 苗发展比较快。将H9N2H A基因克隆到pCAGGS 载体，然后将其与树枝状聚赖氨酸（DGL)装载制备成新型质粒疫苗pCAGGS-〇pti441-HA/DGL，用其免疫 SPF 鸡后，CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+T 细胞 比值大幅度上升，能够完全保护鸡免受H9N2的感 染[26]。将病毒DNA和荧光蛋白克隆到plRES表达 载体，获得plREGFP_H5质粒，然后将其与银纳米颗粒(AgNPs)进行装配，转染至鸡胚十二指肠的原代细胞，可促进白细胞介素IL-18JL-15和丨
的表达#。禽流感mRNA疫苗主要是由非复制型(non-replicating) mRNA 和自我扩增型（self-ampli- fying) mRNA制备而成。将H9N2 H A2和M2e蛋白 的mRNA封装人壳聚糖纳米颗粒（C N P)，免疫SPF 鸡后，可以诱导针对A IV的广泛保护％；由HA mRNA 与脂质纳米颗粒（LNPs) 制备生成的HA mR- NA-LNPs，免疫小鼠、家兔和雪貂，可诱导针对禽流感病毒H A茎部的抗体反应％。
2.3重组蛋白
重组蛋白是指通过原核蛋白表达系统、哺乳动物细胞蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统等而获取的特定目的蛋白。利用昆 虫细胞表达系统获取的重组血凝素蛋白（H A)，以 C a P N P为佐剂，免疫小鼠，C a P N P浓度为0.24%时，就能够诱导机体产生高水平的IgG抗体用流感
血凝素（3H A)制成的交联蛋白纳米颗粒，室温下可以保存112 d,37 °C保存2周其血凝活性保持不变[47]。纳米颗粒包裹重组蛋白能够大幅度提升疫苗诱导的抗体效价，同时纳米颗粒也可以作为二联或多联疫苗的载体。流感病毒与猪圆环病毒的重组蛋白(C a p-3M2e V L P s)免疫猪后，能够诱导高水平的M 2e
1576中国忾K科学第50卷
特异性抗体和P C V2特异性抗体21。
3免疫接种的途径
3.1饮水免疫
饮水免疫操作简单、便捷，是指将疫苗直接输送到消化道的一种免疫方法。饮水免疫属于黏膜免疫，研究表明口服弱毒疫苗可诱导小肠黏膜中产生大量的I g A分泌细胞夂，而I g A分泌细胞对防止病原微生物的人侵发挥重要的作用19。饮水免疫不需要复杂的操作流程，对禽类造成的应激小。但是，饮 水免疫对于水质的要求比较高，同时不能与免疫疫苗相互作用。另外，饮水免疫也存在一定的问题，例 如：停水时间过长或过短、疫苗饮水槽位不足、饮水 器不符合要求等，都会影响免疫的效果^;。
3.2肌肉注射免疫
肌肉注射是将疫苗注射到动物肌肉的一种免疫接种方法，分为胸肌注射、腿肌注射和翅膀肌肉注射三种51]。肌肉免疫适用于无刺激性或者刺激性比较小的疫苗，而纳米颗粒疫苗一般是无刺激性的，肌肉免疫时能够很好地被机体吸收。肌肉免疫方法的优点是药液吸收快，方法简便易行，缺点是注射量不能过大，因为有些疫苗会损伤肌肉组织，如果注射部位不当，可能引起跛行纳米颗粒疫
苗的免疫原性强，正好弥补了肌肉免疫的缺陷，只需要微量的剂量就能够诱导机体高水平的免疫反应。
3.3滴鼻、点眼免疫
滴鼻免疫就是将疫苗滴注于家禽的鼻孔内部，而点眼免疫就是将疫苗滴注于家禽的眼睛，两者都是通过黏膜免疫激发机体针对抗原的特异性免疫反应。黏膜是病原微生物侵入的最大门户，有95%的感染都发生在黏膜或由黏膜侵人机体，黏膜既可刺激产生局部免疫，又可建立针对相应抗原的共同黏膜免疫系统工程，对抗原或病原体产生高效的体液和细胞免疫[52]。滴鼻、点眼主要引起黏膜免疫，优 点是不受母源抗体影响、免疫效果好、保护力强、操 作简单不需要复杂技术。缺点是对非复制型和亚单位疫苗的效率较低，因为黏膜表面存在各种解剖学和生理学障碍，会阻碍机体对于疫苗的摄取与吸收:40]。
4结语与展望
茅于海
本文从纳米颗粒种类、疫苗抗原类型和免疫接种途径三个方面进行阐述，展示国内外禽流感纳米颗粒疫苗研究进展。涉及高度功能化、有良好免疫激发作用且粒径微小的禽流感纳米颗粒疫苗，例如
H5N1V L P、H卜SS-叩、Tetra-M2e、p C A G G S-〇pti44 卜
H A/D G L等。虽然纳米疫苗的研究进展迅速、免疫
效果良好、制备流程也并不复杂，但要制备高度功
能化、粒径小、颗粒均匀的纳米疫苗却并不容易。未 来，可以通过进一步改造抗原和完善纳米疫苗制备
流程，从而研制出一种易于制备、结构稳定、免疫途
径简单快捷、高效的通用型禽流感纳米疫苗。以期
通用型纳米疫苗能够提供针对不同亚型的交叉保
护作用，实现一针能预防与控制所有亚型的禽流感
病毒。同时，疫苗佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂以及
其他辅助性试剂的研发，也将进一步提升纳米颗粒
疫苗的效果。而探索简单高效的免疫接种途径，更
容易提升疫苗的效果，从而减少禽类疾病的发生。
微针，一种新型纳米颗粒疫苗的传输装置，使用简
单便捷，不需要专业的操作技巧。该装置直接将纳
米疫苗传递到表皮和真皮层，在树突状细胞和表皮
朗格汉斯细胞密集的地方发生反应2|1，从而达到预
防疾病的作用。未来还可能会有更多的新型免疫装
置的出现以及纳米疫苗的产生。
参考文献（R eferen ces)
[1]高晓艺，蒋菲，王传彬，等.H5亚型禽流感病毒样颗粒的
制备及其免疫原性的初步研究[J].中国涔医科学，2019,
49(08)：961-968,
GAO Xia〇-y i,JIANG Fei,WANG Chuan~bin,et ai. P r e
paration and immunogenicity of H5 subtype avian
influenza virus-like particles [J]. Chinese Vete
rinary Science,2019,49(08) ：961~968. (in Chinese) [2]艾重阳，赵茜茜，吴宛芹，等.生物合成的银纳米粒子眹
学应用潜力[J]•生命科学，2020,32 (06) :630-640.
AI Chong-yang,ZHA0 Xi-xi,WU Wan-qin,et ai. Medi
cal applications of biological silver nanoparti-
cles[J ].Chinese Bulletin of Life Sciences, 2020,32
(06) :630-640. (in Chinese)
[3] PREL A,LE GALL-RECULE G J E S T I N V.Achievement of
avian influenza virus-like particles that could
be used as a subunit vaccine against low-pathogenic
avian influenza strains in ducks [J]. Avian Pathol
ogy ,2008,37 (5) ：5\3~520.
[4] SMITH 1,0' KENNEDY M M,WANDRAG D B R,et ai. Efficacy
of a plant-produced virus-like particle vaccine
in chickens challenged with influenza A H6N2 virus
[J]. Plant Biotechnology Journal,2020,18 (2) ：502-
512.
[5] KANEKIY0 M,WEI C J,YASSINE H M,et ai. Self-assem
bling influenza nanoparticle vaccines elicit
broadly neutralizing H1N1 antibodies[J]. Nature,
豫公网安备41160202000603
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