中国动物传染病学报 2011,19(1):1-10Ch i nese Journal o fA n i m al Infecti ous D iseases 研究论文
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒H u N4株及其致弱过程中的不同代次病毒的分子特征分析 周艳君1，田志军2，郝晓芳2，安同庆2，于海1，李国新1，陈瑾2,
彭金美2，童光志1
(1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241;2.中国农业科学院哈尔滨
兽医研究所，哈尔滨150001)
摘 要：为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(H igh l y pathogenic porc i ne reproducti v e and respiratory syn dro m e v irus,HP PRR S V)毒力逐渐减弱的分子轨迹，我们以H P PRR S V亲本毒H u N4株及其系列传代致弱毒株为研究对象，对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒H u N4株到无致病性的F112代的疫苗毒，共有65个核苷酸发生突变，其中导致41个氨基酸发生突变，这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性J XA1株及其致弱毒株J XA80株相比较，可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同，二者之间不仅氨基酸突变数量不一致，而且突变氨基酸的位置也不完全相同，但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中，突变率较高的结构蛋白相一致，突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提 示我们决定高HP PRR S V毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的，推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的，同时也使我们认识到PRR S V的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。
关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株；二疫苗毒H u N4 F112；突变
中图分类号:S858.282.659.6文献标识码:A文章编号:1674-6422(2011)01-0001-10
MOLECULAR CHARACTER IZAT ION OF H IGHLY PATHOGEN IC PORCINE REPRODUCT IVE AND RES O IRATORY S YNDRO M E V IRU S(Hu N4)AND ITS ATTENUATED S TRA IN ZHOU Y an j u n,T IAN Zh i jun,HAO X iao fang,AN Tong qing,YU H a,i LI Guo x i n,
CH E N Ji n,PENG Ji n m e,i TONG G uang zhi
(1.Shanghai Veter i nary R esearch Institute,CAAS,Shanghai200241,China; 2.H arb i n Veter i nary R esearch Institute,
CAAS,H arbin150001,Ch i na)
Abstrac t:To i dentify the possi b l e s i tes o f attenua ti on,genom i c character i zati on of H i gh l y p
a t hogen i c porc i ne reproducti ve and resp ira tory syndrom e v i rus(PRRSV)stra i n H u N4and its attenuated inter m ediates w as descri bed.The results show ed that there are a tota l of65nuc leo ti de mu tati ons,wh ich cause muta tions i n41a m i no acids,bet w een H uN4and its attenua ted strai n at passage112th(H u N4 F112).These mu tati ons o f am i no aci ds present i n different reg ions o f the genom e.T he attenuati on process o fH u N4is no t ex actl y sa m e as prev ious repo rt about the attenuation o f h i ghly pa t hogen ic J XA1stra i n and its attenuated J XA80stra i n.N o t on l y t he nu m ber of muta tions o f a m i no aci ds bet ween the t w o stra i ns is i nconsistent,but the locati on o f a m i no aci d muta ti on is not exactl y the sa m e.H ow ever,dur i ng t he attenuation ofH u N4and J XA1,struc t ura l pro teins and non structura l
收稿日期:2011 01 30清教徒的假面
基金资助:N SFC 广联合基金项目(U0931003)；上海市科技人才计划项目(09XD1405400)；中央科研院所公益性基础科研业务费项目(2011JB03)
作者简介：周艳君，女，博士，主要从事猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)和猪流感研究
通信作者：童光志,E m ai:l gzt ong@shvr.i ac
2 中国动物传染病学报2011年1月
建湖县森达小学
prote i ns w it h higher muta tion rate are sa m e.The ana l ysis result sho w ed that the h i ghly pathogenic PRRSV v i rulence factors m ight not be deter m i ned by a s i ng le am i no ac i d mutati on,and m igh t be deter m i ned by one gene or mu lti ple genes.T he res u lt a l so revea l ed that t he non structural pro tein m i ght play an i m po rtant ro le i n the change o f PRR S V v iru lence.
K ey word s:H i ghly pathog en i c porc i ne reproducti ve and respiratory syndrom e v irus(HP PRR S V)stra i n H uN4;vacc i ne stra i n HuN4 F112;muta tion
猪繁殖与呼吸综合征(porcine repr oducti v e and resp iratory syndr o m e,PRRS)从发现到现在已经经历了20多年历程，但目前该病依然是危害养猪业的重要动物疫病[1 3],PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porci n e reproducti v e and resp iratory syndro m e v irus,PRRSV)引起的，以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄阶段的猪出现呼吸道症状和高死亡率为主要特征的传染病[4 5]，我国于1996年首次发现PRRS并分离到该病病原[6]，自此该病就一直在我国流行。尤其是2006年由PRRSV变异株引起的 猪高热综合征 其发病率从50%~100%，死亡率从20%~100%不等。由于此次PRRS流行范围广、造成损失严重、感染猪死亡率高是前所未有的，因此农业部将其定名为 高致病性猪蓝耳病 。随着我国特有的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(H igh ly pathogenic porc i n e reproductive and resp iratory syndro m e v ir us,H P PRRSV)毒株的出现,PRRS疫情变得更加复杂化。与以往经典毒株相比较，高致病性PRRSV变异株细胞适应能力显著提高，抗原性增强，在猪体内
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增殖更快、病毒血症出现的时间更早，致病性和致死能力明显增强[7 10]。目前高致病性猪蓝耳病已经被我国列为一类动物传染病。
迄今为止HP PRRSV毒株在我国猪中依然存在，再加上一些中小型养猪场存在管理不规范等诸多因素，导致目前高致病性猪蓝耳病疫情在一些地区仍然很严重，使HP PRRSV毒株成为我国近年来流行的优势毒株[11 12]，其毒力和致病性丝毫没有减弱的趋势。H P PRRSV与早期流行的经典毒株CH 1a株相比其核苷酸同源性在94.9%~95.4%左右，最具特征的是在NSP2出现了30个氨基酸的缺失,N s p2在5 端与3 端非编码区各有一处核苷酸缺失。随着这些变异的核苷酸以及碱基缺失等差异的出现，使得变异毒株所表现出来的细胞适应性、致病性等也明显不同[7,10]。目前在我国PRRSV的存在形式是多样的，既存在基因组无缺失的经典毒株[6,13 14]，又存在N sp2基因编码区核苷酸不同数量缺失的变异毒株等等[7 8,15 16]，这样就使我国PRRS疫情趋于复杂化，进而加重了防控PRRS的难度。为了能够到防制高致病性猪蓝耳病的有效途径，我们将本研究室分离获得的H P PRRSV H u N4株在M arc 145细胞上进行了连续性传代，并结合动物实验，最终我们获得了能够对猪提供免疫保护的弱毒疫苗H uN4 F112株[17]。与此同时，弱毒株的应用也给我们带来新的问题，究竟是何原因使能够导致猪发病死亡的强毒株毒力减弱演变为弱毒株?为了寻H P PRRSV H uN4株由强毒株演变为弱毒株的轨迹，以HP PRRSV亲本毒H uN4株及其传代致弱的毒株为研究对象，对PRRSV强毒H uN4株及其不同传代致弱的毒株进行全基因组测序，通过对强弱毒株的全基因组核苷酸及氨基酸序列比较分析，探讨了H P PRRSV H uN4株在致弱过程中的分子基础。
1 材料与方法
1.1 毒株及细胞 HP PRRSV亲本毒H uN4株及其传代细胞M arc 145均由本研究室分离和保存[7,10]。H P PRRSV强毒株JXA1以及弱毒疫苗株JXA80毒株的全基因序列参考GenBank登录号EF112445和FJ548853[8,18]。
1.2 亲本毒HuN4株的传代致弱 将强毒株
H uN4株按照一定滴度稀释后接种其传代细胞M arc 145，于37 CO2培养箱中培养，观察细胞病变，当病变达到80%时，收获病毒，以传代获取的病毒作为种毒继续在M arc 145细胞上传代培养，一直传至100代以上。
1.3 亲本毒HuN4株及其传代毒株RT PCR扩增及全基因克隆 参照本研究室分离的H P PRRSV H uN4株(G enB ank登录号EF635006)的全长基因序列合成了8对引物[10](见表1)，引物由I nvitrogen公司合成。利用RNA提取试剂盒(购自Q i a gen公司)，每隔20代左右分别提取病
第19卷第1期 周艳君：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Hu N4株及其致弱过程中的不同代次病毒的分子特征分析 3
毒RNA。然后以提取的H uN4株及其不同代次病毒的RNA反转录产物为模板，利用合成的8个片段引
物分别对不同代次的病毒分别进行RT PC R扩增，通过PCR产物胶回收试剂盒分别回收8个片段PC R产物，克隆于p MD18 T载体上，各基因片段连接产物经PCR鉴定后，分别随机选取10~15个阳性克隆进行序列测定。
表1 扩增P RRSV全长基因的引物
Table1 Pr i m ers for P RRSV fu ll length geno m e
目的片段F ragm ent
引物序列
Sequence o f PCR pri m ers(5 3 )
扩增区域
R eg i ons amp lified
扩增长度
L engths o f PCR products(bp)
A GAATTCATGA CGTATAGGTGTTGGCTCT1-10361057
CATGG C GAATTTCTTTGTACTG
B GTGTCTCCATG CGGGTTGAGTA932-29282016
GGTGCGTCAGCGTTGTTGTC
C TT CGGAAGAAACTGTCGGTG2769-45171771
GA CCACAGTTCTAG CCGTAATCC
D TGAGATCGCCTTCAACGTGTTC4320-62041902
G CAA CCAAGGGCGTCCAG
E TGGCGGAGTGTTCA CTATTGAC5592-78302263
CGCCGGAGATCAAGACATCTATAAG
F GTGGAGCAA
G CCCTTGGTATGA7580-101262546
ATGGTCTGGTGAGTTGG C GTGTA
苄丝肼G AGGTGTTAGAACAAGTCCCGTAT9815-132833406
G CCTGAGAGACCA CGAAA
H TG C AAGCTACG CCTCATACATC11637-153013687
TTAATTA CGGCCGCATGGTT CT
1.4 亲本毒HuN4株及其传代毒株全基因序列分析 将8个基因片段测序结果经序列分析软件比对后进行全长基因拼接，获得各代次病毒的全基因组序列，然后利用分子生物学软件对各代次病毒结构蛋白和非结构蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列进行序列比较分析，并获取能够区别于强弱毒株的特征性氨基酸位点的变化。
1.5 H u N4株与不同毒株之间遗传变异轨迹分析 将两对具有同样致弱经历的国内代表株H uN4/H uN4 F112毒株和J XA1/J XA80毒株的全基因序列进行比较分析，以期寻其具有规律性的变化。同时综合此前有人报道的对经典PRRSV毒力相关位置氨基酸变化的信息[19]，结合分析结果评价其与毒株毒力变化的相关性。
2 结果
2.1 亲本毒与不同代次毒株的基因组核苷酸与氨基酸突变分析 利用DNAStar软件对高致病性亲本毒H uN4株及其传代毒H uN4 F20、H uN4 F40、H uN4 F65、H uN4 F84、H uN4 F100、H uN4 F112病毒的全基因组中各个结构蛋白基因及其非结构蛋白基因进行核苷酸与氨基酸序列比较，统计结果发现亲本毒H uN4经传代后不同代次的病毒在非结构蛋白区和结构蛋白区都有不同数量的核苷酸或氨基酸发生突变，其中核苷酸突变总数为65个，氨基酸突变总数为41个(见表2)，在亲本毒致弱过程中变化特征主要表现在发生
4 中国动物传染病学报2011年1月
突变的核苷酸和氨基酸呈分散性存在，而且突变的核苷酸与突变的氨基酸不是一一对应的关系(见表3)。在整个传代过程中当亲本毒H u N4株传至F84代时发生突变的氨基酸达到了38个，当传至F100代以后，氨基酸遗传性能基本稳定，仅有3个氨基酸发生突变。在整个传代过程中,5 和3 非编码区以及ORF7编码的核衣壳蛋白未发生核苷酸或氨基酸的突变或缺失、插入等现象。从H uN4传代至F112代共有6个位置氨基酸发生回复性突变，其氨基酸突变统计结果(见表4)。
表2 PRRSV强毒株H uN4株传代过程中发生突变的核苷酸与氨基酸数量统计
T ab le2 Number of nu cleo ti de and a m i no aci d changes in the6d ifferent passages
不同代次
D ifferent passages
HuN4F20H u N4F40H u N4F65H u N4F84H u N4F100H u N4F112突变核苷酸数量283649626265
突变氨基酸数量152127383941
表3 亲本强毒H uN4株与弱毒株H uN4 F112株核苷酸与氨基酸突变统计
Tab le3 Nu cleoti de and a m i no aci d m utati ons of HuN4and H uN4 F112
基因G ene 蛋白
P ro te i n
核苷酸位置
Nuc l eo tide positi on
氨基酸位置
Am i no ac i d position o fOR F
H u N4HuN4 F112
N AA N AA
ORF1a N sp1675162A L G L
780197A G G G
788200C S T F
1217343T V C A
1257356A R G R N sp21391401A H G R
1619477C T T I
2584799G D A N
2867893T V C A
3124979T S C P
33681060A N G S
35951136T C A S
37621191A A G A
40891300C V A V
42001337C Y T Y华亚纸业
45401451A T G A N sp349351582T G C G
51201644C A T V
54031738C G T G N sp456731828C S T S
59701928T G C G
61221978C A T V N sp561872000A R C R
63242045G A A A N sp768472220A I G V
68762229T D C D
74222411T G C G N sp875572456G K A K
75782463G Q A Q
第19卷第1期 周艳君：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Hu N4株及其致弱过程中的不同代次病毒的分子特征分析 5
(续表)
基因G ene 蛋白
P ro te i n
核苷酸位置
Nuc l eo tide positi on
氨基酸位置
Am i no ac i d position o fOR F
H u N4HuN4 F112
N AA N AA
ORF1b N sp9766222A T G A
777058T Y C H
778462G R A R
7966123C A T V
8240217T S C P
9057490G R A Q
9111505A I C L天堂的
9135513C L T L
9317573C L T L
9486630G V T F N sp109703702A K G R
9733712A E G G
10472958G Q A Q
107031035C L T L N sp11114211275C H T Y
N sp12119201441C T T I ORF2a G P2*******G L A L
1213150A Y C S
12302107C T T I
12334118A I G V
12342120A E T D
12511177T S G A
12731250C T T I
12747255A S G S ORF2b E1201230G D A N
1213150A L C F ORF3G P3*******C N T N
1274748A M G V
13277224G Q A Q
13349248T F C F ORF4G P4*******G D A N
1334967T S C P
13520124A I G V
13535129G V A I
13629480A E G G
13633483C T A T ORF5G P5*******A N G D
1383647C L T L
14284196A Q G R ORF6M1447263T V C A ORF7N1504482C A A A
注:N=nucleoti de;AA=am i no aci d
表中斜体加粗字体表示核苷酸的突变导致相应的氨基酸也发生突变；未斜体及未加粗黑字体表示核苷酸突变，但相对应的氨基酸未发生改变。
N o te:T he letters i n bo ld and ita li c represent nt mu tated and aa m utated,and other l e tters represen t nt muta ted but aa not mu tated
6 中国动物传染病学报2011年1月
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