王欢欢萇彪李炜温宁
【摘要】目的：研究高糖环境下光生物调节作用对成骨细胞增殖、分化的影响。方法：将成骨前体细胞MC3T3-E1分为对照组、光照组、高糖组和高糖+光照组，首先用CCK-8法检测各组24h、48h和72h的细胞活力，然后检测14天碱性磷酸酶染情况及其活性，并对21天钙结节进行茜素红染并半定量分析，实时荧光定量PCR检测21天成骨相关基因OCN、Runx2的表达，最后统计学分析各组间的差异。结果：与对照组相比，光照组在24h、48h、72h的细胞活力增强，14天时碱性磷酸酶染及活性增强，21天钙结节形成增加、OCN 和Runx2的表达上升；与对照组相比，高糖组在48h、72h的细胞活力下降，14天时碱性磷酸酶染及活性减弱，21天钙结节形成减少、OCN及Runx2的表达降低；高糖+光照组与高糖组相比，在24h、48h、72h的细胞活力升高，14天时碱性磷酸酶染及活性增强，21天钙结节形成增加、OCN和Runx2的表达增强；高糖+光照组与对照组相比，在21天时钙结节形成增加，其余指标差异无统计学意义。结论：在高糖环境下，成骨细胞经光生物调节作用，可补偿高糖对细胞增殖分化的抑制，可为促进高糖环境下颌骨缺损的< 档案解密全集2012关键词：光生物调节作用；高糖环境；成骨细胞；颌骨缺损
［中国图书分类号］R783［文献标识码］A D01:10.19749/j.cjgd.l672-2973.2021.03.001
Effect of photobiomodulationon osteoblasts in high glucose environment in vitro
WANG Huan—hua(+CHANG Biao,LI Wei,WEN N ing.(Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University G Chinese Academy ofSciences G Chinese PLA General Hospital,Beijing100050,China)
［Abstract］Objective:To study the effect of photobiomodulation(PBM)on the proliferation and differentiation of osteoblasts in high glucose environment.Methods:MC3T3-E1cells were divided into four groups:control group,light group high glucose group,and high glucose+light group.CCK-8method was used to detect the cell viability of MC3T3-E1cells at24h, 48h and72h,alkaline phosphatase staining and its activity at14d were detected,alizarin red staining and semi quantitative analysis were performed on calcium nodules at21d,and the expression of osteogenic related genes OCN and Runx2at21d were detected by real-time quantitative PCR.Finally,the differences between the groups were statistically analyzed.Results: Compared with the control group,the cell viability of t he light group increased at24h,48h and72h,the alkaline phosphatase staining and its activity increased at14d,the calcium nodule formation increased at21d,and the expression of OCN and Runx2increased;Compared with the control group,the cell viability of high glucose group decreased at48h and72h,the staining and activity of alkaline phosphatase decreased at14d,the formation of cal
cium nodule decreased at21d,and the expression of OCN and Runx2decreased;Compared with the high glucose group,the viability of cells in the high glucose+ light group was increased at24h,48h and72h,the alkaline phosphatase staining and activity increased at14d,the calcium nodule formation increased at21d,and the expression of OCN and Runx2increased;The calcium nodule formation increased at21d in the high glucose+light group and the other indexes were not statistically significant compared with the control group.Conclusion:Low level laser irradiation of osteoblasts can compensate the inhibition of cell proliferation and differentiation caused by high glucose,which can provide a theoretical basis for promoting the repair of j aw defects in high glucose environment.
Key words:photobiomodulation(PBM);high glucose environment;osteoblasts;jaw defects
水基金项目：国家自然科学基金（项目编号：51972339）
王欢欢首都医科大学附属北京友谊医院口腔科医师北京100050
萇彪解放军总医院第一医学中心激光科主治医师北京100853
李炜中国科学院博士北京100049
温宁通讯作者解放军总医院第一医学中心口腔科主任医师教授北京100853
・129・
由外伤、炎症、肿瘤等引起的颌骨缺损在口腔临床中极为常见，而糖尿病患者因机体长期处于高血糖水平，会引起骨代谢紊乱，影响颌骨缺损修
复[I]O有研究表明，光生物调节作用（photobio-modulation,PBM）可以作用于骨缺损区促进骨再
生[2-3]o光生物调节作用又叫做低强度光疗、弱激光等，主要指利用低强度的激光照射组织或细胞，引起光生物的。光生物调节作用度会明高，会组织或生
可逆性损伤⑷。本研究主要探讨了高糖环境下，光生物调节作用对成骨殖的影响，以期为促进高糖环境下颌骨缺损的修复。
1.材料和方法
I.I主要材料和仪器成骨细胞前体细胞MC3T3-EI细胞株（中国科学院细胞库）、CCK8试（，中）、
（Sigma-Aldrich，美国），碱性磷酸酶检测试剂盒（，中）、（，中国）、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix （TOYOBO，日本）、SYBR®Green RealtimePCR Master Mix-Plus（TOYOBO，日本）、BCA试剂盒（上海碧云天，中国）。
半导体激光器MDL-III-808nm-FC（808士5nm，长春新产业光电技术有限公司，中）、倒置光学显微镜BX53（Olympus，日本）、细胞培养箱（Thermo，美国）、分光光度计（BioTek，美国）、QuantStudio7Flex Real-Time PCR仪（Thermo,）。
1.2细胞培养MC3T3-EI以a-MEM培养基（含胎牛血清I0%、双抗I%、葡萄糖浓度5.5mmol/L）在培养箱中（37\、5%COJ培养，每两天更换一次培养基，待细胞融合至80-90%时进行传代培养。进成骨，为成骨（有
松I0nM、"一磷酸甘油10mM、维生素C50ug/mL 的a-MEM）。
I.3实验分组实验分为四组，分别为对照组、光照组、高糖组、高糖+光照组。对照组和光照组在低糖培养基（葡萄糖浓度5.5mmol/L）中培养，高糖组和高糖+光照组在高糖培养基（糖浓度25mmol/L）中培养。待细胞贴壁后，光照组和高糖+光照组给予808nm近红外激光连续照射（20mW/cm2，I0min，I2J/cm2），每天一次。激光器输出功率为320mW，方形光斑边长4cm，照射距离50cm。
I.4细胞活力检测将MC3T3-EI接种于96孔板中（2.0XI03个/孔），置培养箱孵育过夜（5%CO2,37C）。待细胞贴壁后，按实验分组给予相应处理。分别在24h、48h和72h，参照CCK-8说明书定各孔的吸光值，式计算每组的细胞活力。每组设置5个复孔，实验重复3。
细胞活力（％）=组吸光度一空白照孔吸光度g
照组吸光度-空白对照孔吸光度
I00%
I.5碱性磷酸酶染将MC3T3-EI接种至48孔板（I.0XI04个/孔），培养箱中孵育24小时后，按组给予相处。各组
鲜成骨，I4进行碱性：移除，钙离子的PBS f 洗3次！4%多聚甲醛固定20min，超纯水清洗两遍！300#L碱性磷酸酶染液染I5min，超纯水洗去未结！光观察，相机拍摄大体图。每组设置3个复孔，实验重复3次。
I.6碱性磷酸酶活性检测将MC3T3-EI接种至6孔板（2.0XI05个/孔），培养箱中孵育24小后，按组给予相处。3各组鲜成骨，I4进
活：移除，不含钙离子的PBS清洗3次！加入I00#L IP裂解液！收集细胞裂解液到EP管！I2000g,4j，离心5min，取上清！B CA样本蛋白浓度！参照碱性
活说明书，各组405nm 吸光度，并换算出碱性磷酸酶活性。
1.7茜素红染将MC3T3-EI接种至48孔板（I.0XI04个/孔），培养箱中孵育24小时后，按组给予相处。
3各组鲜成骨，2I进：移除培养基，不含钙离子的PBS清洗3次T4%多聚甲醛固定20min，超纯水清洗两遍！300#L茜素红染30min，超纯水洗去未结合染液！光学显微镜观察，相机拍摄大体图。用Image Pro Plus
•130・
6.0对钙结节染面积进行分析。每组设置3个复孔，实验重复3次。
1.8实时荧光定量PCR检测成骨基因OCN、Runx2表达将MC3T3—E1接种至6孔板(
2.08 109个/孔)，培养箱中孵育24小时后，按实验分组给予相应处理。每3天各组更换对应新鲜成骨诱导培养液，培养至21天时参照TRIZOL试剂盒说明书提取细胞总RNA，并检测RNA浓度。根据ReverTra Ace qPCR RT Master Mix试剂盒说明书进行逆转录：5x RT Master Mix2puL,RNA模板1!g(x pL),DEPC~(8-x)pL,37°C15oin T98°C 5oin T4°C维持。最后进行PCR：维持阶段：95S 60s!循环阶段(40次)：95T60s,60U15s,72V 45s!分析。生工合成(见表1)。用2-AA Ct法计基因的相对表达。
表1成骨基因引物序列
基因 序列(5!3‘)
F:CATCTTCCAGGAGCGAGACC GAPDH
R:CTCGTGGTTCACACCCATCA
F:CGCTCTGTCTCTCTGACCTC
OCN
R:CGCCGGAGTCTGTTCACTAC
F:GCGCATTCCTCATCCCAGTA
Runx2
R:CTGGCTCAGATAGGAGGGGT
计，48h、72h时细胞活力提高(!<0.01,!<0.001)；高糖+光照组与对照组相比，在24h、48h、72h时细胞活力无统计学差异。
图124h、4'h、72h各组细胞活力
(*!<0.05,**!<0.01,***!<0.001)
■对照组
■光照组
高糖组
高糖+光照组
2.2光生物调节作用对染及活性的影响我们在14天时对碱性磷酸酶进行染，并对进行定量分析。2,
染成蓝，大体图和镜下图不能明显区分各组染强度。定量结果显示(图3)，与对照组相，光照组，组，计(！<0.01),+光照组与高糖组相比，碱性磷酸酶活性增高(!<0.05)；高糖+光照组与对照组相比，帀
计学差异。
1.9统计学分析所有数据均使用x±SD(平均值士标准差)表示，采用GraphPad Prism6制作图表并进行计分析，因分析(o n eway-ANOVA)评价多组间的统计学差异，！<0.05表示
计(*表示！<0.05,
**表
!
<0・01,
***表示！<0.001)o
2・结果
2.1光生物调节作用对MC3T3-E1细胞活力的影响在本研究中，我们采用了808nm近红外激光连续照射，功率密度20mW/cm2，照射时间为10min，能量密度为12J/cm2。从图1可以看出，在24h时，与对照组相比，光照组MC3T3-E1的细胞(!c0.05)，组计
48h、72h时，对照组相，组细胞
(!c0.05、!c0.001)，光照组细胞
(!<0.001)；
+光照组组相比，24h时细胞
a214天时染情况
镜
下
图
大
体
图
(6uvnul)
5
l
fe d
J
<
图314天时碱性磷酸酶活性(*!<0.05,**!<0.01)
2・3光生物调节作用对细胞外钙沉积的影响
・131・
细胞外钙沉积能被茜素红染成红，是反应成骨细 胞分化终末阶段的重要指标。从图4中可以看出，
各组钙结节呈现出不同程度的点状沉积。为了更好
的对钙沉积水平进行评价，我们用Image ProPlus
6.0对钙结节染面积进行半定量分析（图5）o 结
果显示，与对照组相比，光照组钙结节明显增多 （!<0.001），高糖组钙结节显著减少（！
<0.05）；高
糖+光照组与高糖组相比，钙结节显著增加；高
糖+光照组与对照组相比，钙结节也相对增加,
差异
（！
<0.01）。
镜
新型太阳能热水器
下图
大体图
图4 21天时细胞外钙沉积情况
0.0
对照组 光照组 高糖组高糖+光照组
pku苯丙酮尿症图5 21天时细胞外钙沉积半定量图
（*!<0.05, **!<0.01, ***!<0.001）
2.4光生物调节作用对成骨基因0CN 、Runx2 表达的影响 骨钙素（Osteocalcin , 0CN ）是一种
骨基质蛋白，由成骨细胞合成并分泌，在成骨细 胞分化及骨基质矿化中起重要作用⑸ Runx2作为
细的异
与多种成骨分化 程⑹。
中我们 了 21天MC3T3-E1中OCN 和Runx2的表达。如图6所 示，与对照组相比，高糖组OCN 和Runx2的表
达受到了抑制（！<0・01、！<0・05），光照组OCN 和
Runx2的表达增强（！
建筑安全生产管理制度
<0.01）；高糖+光照组与高
糖组相比，OCN 和Runx2的表达增强（！
<0.05,
!
<0・01）；高糖+光照组与对照组相比，OCN 和
Runx2的达 差异。
刘腮因帽灰
S N O O
1.75-1 ——竺__,
放 1.50-常 1-25_
-------1 -
gl 1.00-星 0.75- I g 0.50- I H 0.25- I
0.00 ------------------------------------------对照组 光照组 高糖组高糖+光照组
图6 21天时成骨基因相对表达情况（*!<0.05, **!<0.01）
3•讨论
糖尿病，由于肥胖和人口老
化的影响
中中 糖
病患者数排名第一⑺。
是糖尿病重要并
一⑻，糖 可影响 的 :
，导致骨质
不。 ，糖尿
的骨折愈合时间延长了 87%⑼，其中2型糖
尿病患者牙槽骨再生量约减少55%[10]o 研究显示, 高糖 可 钙 ， 成骨细
的增殖和分化，打破骨 平衡，使糖尿患者骨愈
合受损⑴。在本实验研究中，与对照组相比，高糖
组细胞活力下降，钙结节明显减少，碱性磷酸酶活 性降低,OCN 及Runx2的表达下降，说明在高
糖 中成骨细胞的增殖分化受到了抑制，与目
前的
结论相同。
大量研究表明，光生物调节作用具有减轻炎
数值仿真
症反应、促进伤口愈合、营养神经等作用，并且
能够促进骨 2引。 节作用机主要通
过细胞素c 氧化酶吸收光子提高线粒体功能, 促进ATP 生成，同 影响细
中重要的酶,
促进各种
达，活氧及一氧化氮在此过程
中也被认为发挥重要作用mgo Pyo 团队研究了
808nm 激光照射（功率密度80mW/cm 2，能量密度
1.2J/cm 2, 24 h/次，共3次）对低氧环境下人成骨
细胞的影响，结果显示 节用可促进低氧
・132
・
环境下骨形成蛋白2、骨钙素、转化生长因子！1基因的表达呵。Michael用820nm8-铝一：化物(Ga-Al-As)激光照射下颌牵张成骨动物模型新西兰大白兔(功率400mW，能量6J，共6个位点)，结果发现光生物调节作用能促进牵张成骨过程中骨再生，联合弱激光进行牵张成骨，可缩短周期冋。Aras等用808nm激光(功率密度250mW/cm2，能量密度5J/cm2)对安装有扩弓矫治器的骨质疏松大鼠腭中缝进行照射，，共照射4次，研究显示光生物调节作用能成骨量问。Khadra研究弱激光(1.5J/cm2和3J/cm2)对人成骨钛植入材料上增殖分化的影响，结果表明光生物调节作用能促进植入体周围组织细胞的增殖与分化，进而促进种植体与周围骨组织的早期愈合[16]…上结果均表，光生物调节可促进颌骨中成骨细胞的增殖与分化。在本研究中，光照组与对照组相比，成骨细胞MC3T3-E1细胞活力增强，钙结节、碱性磷酸酶活性增强、OCN Runx2表达上升，说明光生物调节可促进成骨细胞的增殖和分化，上述报道结果。
，光生物调节作用可
膜溃疡引起的炎症反应"%。有报道运用能量密度为8J/cm2，波长为660nm的Ga-Al-As激光照射牙周炎部位，发现牙周膜细胞TNF-"、IL-10、IL-6和IL-8的表达下降，细胞内cAMP的浓度上升，周的["8%。光生物调节作用与联合用，的果。2020 Thalaimalai光生物调节作用
板的纤维蛋白(PRF)联合牙周，结果
在6个，用PRF，联合组(BI)周度(PPD)、对临床附着水平(CAL)、牙槽骨高度等标["S%。此，有文章总结光生物调节作用糖尿病中的应用，光生物调节作用可胰岛素抵抗、降低糖耐量，改变氧化应激状态[20]，但光生物调节作用对高糖环境下颌骨修复的影响未见报道。
实验中，我们高糖环境下，光生物调节作用对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。CCK8实验结果提示，与高糖组相比，高糖+光照组可促进MC3T3-E1的细胞活力，并随时间延长，促进效果越显著；细胞分化实验结果显示，在弱激光的照射下，处于高糖环境的成骨细胞MC3T3-E1钙结节增加、碱性磷酸酶活性增强、OCN和Runx2表达上升，光生物调节可促进高糖环境下成骨细胞的增殖与分化。目前光生物调节作用常用波长为600~1000nm，功率密度主要在1~500mW/cm2，波长、功率密度、照射时间、照射频率、总能量等参数与效果密切相关[12%。本实验仅选择了一种设定的弱激光照射参数，可通过变照射参数进行系列研究，更好的促进成骨细胞的增殖分化。通过深入研究，以期为解决糖尿病患者颌骨缺损修复提供实验依据。
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