.论著.
胞菌体外药敏研究
龚美亮，刘云霞，邹琳
［摘要］目的探讨氨曲南(aztreonam, ATM)与环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)美罗培南(meropenem,MEM)联合应用对多耐药铜绿假单胞菌(multidrug resistant pseudomonas aeruginosa,MDRPA)的体外抑菌效果。方法收集解放军总医院老年病房2018〜2019年分离的MDRPA共62株，采用琼脂平板稀释法，应用棋盘法设计检测不同药物组合对MDRPA的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)，通过计算分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration,FIC)判断联合用药组合对MDRPA的体外抑菌活性。结果ATM与CIP联合后，16.1%表现为协同作用，38.7%为相加作用，43.6%为无关作用,1.6%为拮抗作用；ATM与MEM联用后，3.2%为协同作用,41.9%为相加作用，53.3%为无关作用,1.6%为拮抗作用。上述药物联合应用后，各药MIC50均较前降低，浓度-累积抑菌率曲线较单独应用表现为左移。结论ATM与CIP联用可以提高各自对MDRPA 抗菌作用的敏感性，效果优于ATM与MEM联用。 ［关键词］氨曲南；环丙沙星；美罗培南；铜绿假单胞菌；药物敏感试验
［中图分类号］R97 ［文献标识码］A DOI：10.3969/j.issn.1674-3245.2021.02.013
In vitro drug sensitivity study of aztreonam combined with meropenem or ciprofloxacin to multidrug
resistant pseudomonas aeruginosa
Gong Meiliang, Liu Yunxia,Zou Lin
(Department of Clinical Laboratory,the Second Medical Center of Chinese PLA General Hospital,Beijing100853,China)
Corresponding author:Zou Lin,E-mail:*******************
[Abstract]Objective To evaluate the combined inhibitory effect of aztreonam(ATM)and ciprofloxacin(CIP),aztreonam (ATM)and meropenem(MEM)respectively on clinically isolated multidrug resistant pseudomonas aeruginosa(MDRPA)strains in vitro.Methods A total of62MDRPA strains isolated from the Second Medical Center of Chinese PLA Genneral Hospital between 2018and2019were collected.Combined inhibitory effect of ATM and MEM,ATM and CIP in vitro was assayed by detecting the minimum inhibitory concentration and calculating the fractional inhibitory concentration(FIC)index for62MDRPA strains with the agar dilution method.Results Combined ATM a
nd CIP displayed16.1%synergic effect,38.7%additive effect,43.6%unrelated effect and 1.6%antagonistic effect on MDRPA strains.Combined ATM and MEM showed 3.2%synergic effect,41.9%additive effect,53.3%unrelated effect, 1.6%antagonistic effect on MDRPA strains.The MIC50of these drugs was significantly lower when they were used in combination with their concentration-accumulative inhibition curves shifted to the left.Conclusion Combined ATM and CIP shows a combined synergic and additive inhibitory effect on MDRPA strains in vitro,that is better than the effect of combined ATM and MEM.
[Key words]Aztreonam；Ciprofloxacin；Meropenem；Pseudomonas aeruginosa；Drug sensitivity test
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是医院内常见的条件致病菌，尤其在老年病房内，-离率较高［1-2］o老年患者往往多病共存，接受各种侵入性操作较多，罹患感染性疾病时，病情严重，病程长，致死率高，抗生素应用时间也较长。近年来由于长期大量广谱抗生素的应用，PA对临床常用抗生素的耐药率逐年攀升，单一用药很难达到理想效果，故目前对于多耐药铜绿假单胞菌(multidrug resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA)的往往选择联合用药⑶。氨曲南(aztreonam,ATM)属于单环的B-内酰胺类抗生素，具有免疫原性弱，对青霉素和头抱菌素类交叉过敏少的特点，环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)和美罗培南(meropenem,MEM)都是临床常用对PA有活性的抗生素。本研究拟选
择上述3种抗生素作为联合方案，为临床医生在选择方案时提供参考。
基金项目：军队后勤科研项目(CWS12J131)
作者单位：100853北京，解放军总医医第二医学中心检验科(龚美亮)，保健科(刘云霞，邹琳)通信作者：邹琳,E-mail:*******************
1材料与方法
1.1材料选取解放军总医院第二医学中心老年病房2018年1月~2019年12月各科室送检样本分离的MDRPA，标本类型包括痰、静脉血、尿液。剔除同一患者多次分离到的菌株，共收集62株。患者年龄79~101岁，平均（87.47±3.54）岁。全部菌株经VITEK-2Cpmpact微生物鉴定仪鉴定。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC35218、大肠埃希菌ATCC25922。
1.2仪器及试剂恒温培养箱、低温冰箱（美国THERMO）；比浊仪（法国生物梅里埃）；电子天平（德国赛多利斯）；半自动多点接种仪（日本佐久间）；MH琼脂干粉（美国Thermo FisherOxoid）；一次性使用无菌培养皿（青岛金典）；美罗培南标准品、环丙沙星标准品（中国食品药品检定研究院）；注射用氨曲南（石药集团）。
1.3菌悬液配置复苏保存菌株，培养新鲜菌株16~18h，挑取单个菌落接种于MH琼脂平板上，37七过夜
培养。第2天从MH琼脂平板上用接种环挑取3~5个菌落，在灭菌0.45%盐水中制成菌悬液。用比浊仪将菌悬液校正至0.5麦氏浊度。
常立欣
1.4最低抗生素浓度测定
1.4.1含不同浓度单药抗生素和联合抗生素平板的制备分别将ATM、MEM、CIP溶于灭菌水中，ATM需加入饱和碳酸氢钠溶液。将上述配制好的原液按标准流程分别倍比稀释成2560,1280、640、320、160、80、40、20、10、5、
2.5、1.25@g/ml），共12个浓度。单药平板制备：每个浓度抗生素溶液取2ml 加入18ml MH琼脂溶液（约50T），共20ml，冷却后制成单药平板。联合抗生素平板制备：棋盘法设计，将ATM分别与MEM及CIP按两两组合加入无菌瓶中，其中每种物药物各l ml，共2ml，再将配置好的混合药液物加入融化并冷至50T左右的18ml MH琼脂中共20ml，冷却后制成联合药平板。
1.4.2平板接种根据多点接种仪接种针的位置分布设计好96孔板上的使用区域，在相应位置96孔板中加入200以配制好的菌悬液。应用多点接种仪将配制好的菌悬液分别接种至单药平板及联合药物平板上，将接种好的平板在恒温培养箱中37T 培养16~20h。
1.4.3结果判读单药平板取能抑制细菌生长的最低抗生素浓度记录为最低抑菌浓度（minimum inhibitor
y concentration,MIC）单药。联合抗生素平板选取能够抑制细菌生长的抗生素最佳组合浓度，组合两种抗生素的浓度分别记录为MIC甲药联用和MIC乙药联用，此组合时两药的分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration,FIC）应达到最小⑷。FIC计算公式:FIC=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。FIC判读标准：FIC指数<0.5时，两种抗生素为协同作用；当FIC 指数为0.5~1时，两种抗生素为相加作用；当FIC 指数为1~2时，两种抗生素为无关作用；当FIC指数〉2时，两种抗生素为拮抗作用。
1.5统计学处理使用SPSS19.0软件分析数据，作图使用GraphPad8.0.2完成。计数资料采用（％）表示，药物单用与药物联用MIC值比较应用配对样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1药物联用前后对MDRPA的MIC比较氨曲南和环丙沙星联合应用后，联合后的氨曲南的MIC50下降至单用的1/2,MIC90与之前相同，联合后环丙沙星的MIC50与MIC90分别下降至单用的1/2和1/4；氨曲南和美罗培南联合应用后，联合后氨曲南的MIC50未变化,MIC90下降至单用的1/2，联合后的美罗培南的MIC50与MIC90均下降至单用的1/2；各组联用方案MIC50和MIC90的改变趋势基本与相应组的FIC指数的趋势一致。两组联合方案中，四种药物联用MIC与单用MIC相比，具有明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
表1氨曲南与美罗培南及环丙沙星单用及联用对
朝阳木化石MDRPA的MIC（^g/ml）
抗生素组合-
MIC50MIC90P值
（MIC单用vs.MIC联用）单用联用单用联用
ATM+CIP
ATM32161281280.0005
CIP84328<0.0001
ATM+MEM
ATM3232128640.0003
MEM1686432<0.0001
2.2各组抗生素联用的FIC氨曲南与环丙沙星联用,54.8%的MDRPA表现为联用药效协同或相加作用，主要为相加作用；氨曲南与美罗培南联用，45.1%MDRPA表现为联用药效协同或相加作用，主要为无关作用，见表2。
表262株多耐药铜绿假单胞菌抗生素联用的FIC
分布（%）
联用组合FIC W0.50.5<FIC鱼11<FIC^2FIC>2 ATM+CIP16.138.743.6 1.6 ATM+MEM 3.241.953.3 1.6
2.3各组抗生素联用的浓度-累积抑菌率曲线本研究中氨曲南和环丙沙星、美罗培南联用方案联用后曲线较单独应用时均有不同程度的左移。
3讨论
铜绿假单胞菌属于医院内常见条件致病菌，老年人基础疾病多，卧床比例高，接受深静脉置管、管、尿管等各种留置性管路多，容易引起铜绿假单胞菌定植，一旦免疫力低下时，容易引起相关部位感染。老年人铜绿假单胞菌导致的相关感染，抗生素的使用疗程要要明显长于普通病房，故而在老年病房内所采集的MDRPA的耐药程度更高叫铜绿假单胞菌耐药机制复杂，主要有产各种灭活酶和修饰酶、
膜屏障和主动外排、形成生物被膜等，几乎具备目前已知的所有耐药机制。一旦临床检出MDRPA，在抗生素选择的难度及复杂程度也会增加[6]o随着MDRPA检出率的逐年升高，单一用药甚至某些联合用药疗效也越来越难达到预期目标，临床需要更为合适的联用方案。
氨曲南具有第三代头抱菌素和第四代青霉素的特点，主要与细菌细胞壁上青霉素结合蛋白相结合从而抑制细菌壁生成，其不良反应较少，适合在老年患者中应用叫环丙沙星属于喹酮类抗生素，主要抑制细菌的DNA复制而导致细菌死亡。国外有研究表明单独使用环丙沙星容易引起铜绿假单胞菌快速耐药，且为多药耐药叫本研究中采用氨曲南与环丙沙星联合,54.8%表现为相加及协同作用，联合应用后氨曲南的MIC50下降至联用前的1/2, MIC90未变化，环丙沙星分别下降至联用前的1/2和1/4，证明两种药物适合联合应用。李娜等〔9啲研究也表明氨曲南与其他药物联合应用对铜绿假单胞菌效果较好，本研究结果与其-致。
美罗培南属于碳青霉烯类抗生素，抗菌活性高，但随着使用频率和和强度的增加，耐药率也逐年攀升。王宇航等问报道的铜绿假单胞菌对而美罗培南的耐药率达49.1%；毛磊等[11]报道的MDRPA 对美罗培南的耐药率达79.4%，均处于较高水平。本研究中，氨曲南与美罗培南联用后有45.1%表现为联用药效协同或相加,53.3%为无关作用，氨曲南的MIC50未变化,MIC90下降至联用前的1/2，美罗培南均下降至联用前的1/2。二者联用后，根据FIC指数，联用后最主要的为无关作用，试验效果逊于氨曲南联合环丙沙星。可能与本次入组的MDRPA对美罗培南的耐药机制相关。
本研究中氨曲南联合环丙沙星对MDRPA效果较好，可在老年病房内推广。不同种类抗生素联合应用，为临床抗感染提供了新的思路，联合用药可以降低抗生素的使用剂量，减少耐药突变的发生。同时应监测临床常用抗生素的使用强度，重视临床药敏结果，结合实际情况给出最佳方案，使患者最大获益。
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(收稿日期：2020-10-29；修回日期：2021-01-05)
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