管理・教学
赵颖1!，王瑶1!，徐英春1!，倪安平1!#
(1.中国医学科学院北京协和医院检验科，北京100730#.侵袭性真菌病机制研究与 精准诊断北京市重点实验室，北京100730)
摘要：目的对3种不同厂家的商品化沙眼衣原体即时检测(POCT)试剂盒进行评估，为中国医学科学院北京协和医院检验科实验室及其他医疗机构实验室提供参考&方法采用沙眼衣原体菌株(血清型D和E)冻存毒株，化冻后经细胞培养法滴定确定浓度，使用生理盐水进行系列稀释，对试剂盒A(衣原体抗原检测试剂盒)、试剂盒B(沙眼衣原体抗原检测试剂盒)、试剂盒C(沙眼衣原体抗原检测试剂盒)进行最低检出限和重复性实验&采用人胚肺成纤维细胞、非洲绿猴肾细胞系、大肠埃希菌标准菌株菌悬液进行特异度实验&结果对血清型D的最低检出限，试剂盒B和C浓度均达1.86X107IFU/mL，试剂盒B在1.86X106IFU/mL观察到隐约可见条带；试剂盒A仅能检测到1.86X109IFU/mL。对血清型E检测灵敏度，试剂盒B和C均达2.80X 10KFU/mL，但均为弱阳性；试剂盒A仅能检测到2.80X109IFU/mL。3种试剂盒均有较好的重复性，但均存在阳性条带显示颜强弱不完全一致的情况。3种试剂盒均能够抗
人胚肺成纤维细胞MRC5(29X106/mL)，非洲绿猴肾细胞系BGMK(5.0X106/mL)和标准菌株ATCC25922大肠埃希菌(1.5X108CFU/mL)的干扰&结论试剂盒B和C最低检出限明显优于试剂盒A，但试剂盒B较试剂盒C略好&在特异度和重复性方面3种试剂盒均较好。
关键词：沙眼衣原体；即时检测；最低检出限；特异度；重复性
DOI10.3969/j.issn.16734130.2019.13.030中图法分类号：R446.1
文章编号：16734130(2019)13164705文献标识码:B
沙眼衣原体生殖道感染是最常见传播疾病之一，大多数无症状感染，但若不及时，沙眼衣原体可引起女性输卵管瘢痕化，并可导致女性异位妊娠和输卵管因素不孕、盆腔炎、慢性盆腔疼痛，可引起男性尿道炎、附睾炎、直肠炎，并且衣原体感染会增加人类免疫缺陷病毒(HIV)的易感性&14'。即时检测(POCT)试剂盒能够通过免疫谱法检测生殖道的沙眼衣原体，可用于早期诊断，虽灵敏度(25%〜65%)没有核酸检测方法高，但其可以快速得到结果，从而大大缩短检测和之间的时间，并提高治愈率，不同生产厂家的试剂盒在灵敏度和特异度方面具有差异%本研究对3种不同生产厂家的商品化沙眼衣原体POCT试剂盒进行方法学评价％
1材料与方法
11标本来源
1.1.1BGMK细胞株BGMK细胞株用于沙眼衣原体培养，购自英国南安普顿大学微生物系％细胞培养液为10%胎牛血清D-MEM(HyClone公司)，胎牛血清D-MEM购自Gibco公司％1.1.2沙眼衣原体菌株沙眼衣原体血清型D(D/ IC-Cal-S/ON)和血清型E(E/DK-20/ON)，购自英国南安普顿大学微生物系％
1.1.3沙眼衣原体菌株培养详细方法见文献［9-11'%BGMK细胞生长于75cm2细胞培养瓶(NUNC 公司)，待生长成为单层细胞后倾去细胞培养液，加入沙眼衣原体生长液，即10%胎牛血清D-MEM，含2 g/mL(Sigma公司)％然后分别接种沙眼衣原体血清型D和血清型E，接种完毕后离心细胞培养瓶，即1600r/min(700g,Beckman J6-MC)35j离心60min%离心完毕后置于5%CO2和37j培养72h%倒置显微镜(Olympus IX71)下看见大量生长的沙眼衣原体包涵体％收获沙眼衣原体，即细胞刷(Corning-Costar公司)刮下感染细胞，超声波破碎感染细胞，1600r/min离心10min去除细胞碎片，16000r/min 高速离心10min沉淀衣原体，再悬浮于0.2mol/L蔗糖磷酸盐缓冲液(2SP)，并在液氮内保存％
1.1.4沙眼衣原体浓度确定BGMK细胞生长于含直径13mm盖玻片的24孔细胞培养板(Corning-
*基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-014)；河北省科技计划项目(17277775D)%
#通信作者，E-mail：niap@pumch%
本文引用格式：赵颖，王瑶，徐英春，等.3种沙眼衣原体POCT检测试剂盒性能评估国际检验医学杂志，2019,40(13)16471651.
Costar公司)内，吸去细胞培养液，加入沙眼衣原体生长液％接种上述系列稀释的沙眼衣原体血清型D和E，然后离心24孔培养板，即2400r/min(1500g, Beckman J6-MC)35j离心60min。离心完毕后置于5%CO2和37°C培养48h。吸去培养液，PBS洗涤2次，甲醇固定盖玻片10min%抗沙眼衣原体单克隆抗体(Micro Trak，美国Syva公司)直接荧光法染盖玻片，荧光显微镜(Olympus BX51)下计数包涵体数量，最终换算确定制备的沙眼衣原体血清型D和E浓度分别为 1.86X1011(FU/mL和2.80X1011(FU/mL。IFU为包涵体形成单位。
1.2试剂试剂盒A：衣原体抗原检测试剂盒(胶体金法，韩国Standard Diagnostics，Inc.)。试剂盒B：沙眼衣原体抗原检测试剂盒(乳胶免疫层析法，南京黎明生物制品有限公司)。试剂盒C：沙眼衣原体抗原检测试剂盒(胶体金法，上海凯创生物技术有限公司)%
13试验方法
1.3.1最低检出限检测待测样本沙眼衣原体浓度：沙眼衣原体血清型D和血清型E冻存毒株，经细胞培养法滴定的浓度分别为1.86X1011(FU/mL和
2.80X1011(FU/mL，化冻后使用生理盐水进行系列稀释，见表1。
表1生理盐水进行系列稀释结果
稀释度沙眼衣原体血清型D
186X1011IFU/mL
沙眼衣原体血清型E
280X1011IFU/mL
102186X109IFU/mL280X109IFU/mL 103186X108IFU/mL280X108IFU/mL 104186X107IFU/mL280X107IFU/mL 105186X106IFU/mL280X106IFU/mL
比对方法：(1)2970“L生理盐水+30“L毒株，即为10—2稀释，最终浓度为1.86X109(FU/mL%再取1.86X109(FU/mL沙眼衣原体300pL+2700g L 生理盐水，即为10—1稀释，稀释后浓度为1.86X108 (FU/mL%以此类推至10-5稀释，最终浓度为1.86X 106(FU/mL%先从10-2稀释开始，做好标识，每个浓度分别用加样加50“L至各试剂盒配套拭子上% (2)分别将加样后的拭子，置于对应试剂盒的裂解液内，再滴入检测窗内，按照规定的时间读取结果％以此类推，每个浓度分别检测，直到3种试剂盒均为阴性检测结果％(3)在阴性结果的上一个稀释度(阳性检测结果)，使用生理盐水进行倍比稀释，如1.86X 108(FU/mL，倍比稀释为9.30X107(FU/mL# 4.70X107IFU/mL、2.30X107(FU/mL……同上方法，
postadult
再次对每个浓度分别检测，最终确定每种试剂盒检测灵敏度的浓度绝对值％
1.3.2重复性比对试验使用最终检测阳性结果的上一个滴度进行重复性试验，共计5次，由于沙眼衣原体毒株是活的微生物，且免疫层析方法POCT试剂盒制造及检测步骤简单，故仅进行批内重复性检测％1.3.3特异度试验待测样本：(1)人胚肺成纤维细胞MRC-5，浓度为
2.9X106/mL，超声波裂解物。
(2)非洲绿猴肾细胞系BGMK，系沙眼衣原体的培养细胞，浓度为5.0X106/mL，超声波裂解物％(3)标准菌株ATCC25922大肠埃希菌，采用新鲜纯培养菌株，用生理盐水调制成0.5麦氏单位浓度(1.5X108 CFU/mL)菌悬液％试验方法：上述3个样本，不稀释，分别用加样加50“L至各试剂盒配套拭子上，分别进行检测%
2结果
2.1最低检出限试验结果对于沙眼衣原体血清型D的检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到1.86X107 (FU/mL，结果观察试剂盒B较试剂盒C阳性略明显一些(条带颜更深)，试剂盒B在1.86X106 (FU/mL也隐约可见条带，但试剂盒C在1.86X 106(FU/mL无阳性迹象；试剂盒A仅能检测到1.86X109(FU/mL，并且条带颜较另外两种试剂盒弱％见表2%对于沙眼衣原体血清型E检测，试剂
盒B和试剂盒C均能达到2.80X107(FU/mL，但阳性均为弱阳性；试剂盒A仅能检测到2.80X109IFU/ mL，并且条带颜较另外2种试剂盒弱％
注：w+表示弱阳性，+表示阳性，—表示阴性
表2最低检出限试验结果
血清型试剂盒A试剂盒B试剂盒C 沙眼衣原体血清型D
186X109IFU/mL+++
186X108IFU/mL—++
186X107IFU/mL—++
参政消息报186X106IFU/mL———
186X105IFU/mL———
沙眼衣原体血清型E
28X109IFU/mL+++
28X108IFU/mL—++
28X107IFU/mL—w+w+
28X106IFU/mL———
28X105IFU/mL
———
2.2重复性比对试验结果对于沙眼衣原体血清型D检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到1.86X107 (FU/mL，再进行2倍稀释后检测，2家结果均显示较
弱阳性，因此，选择1.86X107IFU/mL进行重复性试验%试剂盒A仅能检测到1.86X109IFU/mL，并且条带颜较另外2种试剂盒弱，再进行2倍稀释后检测，结果显示较弱阳性，因此，选择1.86X109IFU/mL 进行重复性试验％见表3%
对于沙眼衣原体血清型E检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到2.80X107IFU/mL，但为弱阳性，因此，从2.80X108IFU/mL进行2倍稀释为1.40X108 IFU/mL和7.00X107IFU/mL后分别检测，2家结果1.40X108IFU/mL得到阳性结果，7.00X107 IFU/mL仅得到弱阳性结果，因此，选择1.40X108 IFU/mL
进行重复性试验；试剂盒A仅能检测到2.80X109IFU/mL，并且条带颜较另外2种试剂盒弱，再进行2倍稀释后检测，结果显示较弱阳性，因此，选择2.80X109IFU/mL进行重复性试验％3种试剂盒结果重复时均阳性，但是均存在阳性条带显示颜强弱不完全一致的情况%
表3重复性比对试验结果
血清型试剂盒A试剂盒B试剂盒C
沙眼衣原体血清型D 1.86X109IFU/mL186X107IFU/mL186X107IFU/mL 第1次+++第2次+++第3次+++第4次+++第5次+++
沙眼衣原体血清型E280X109IFU/mL140X108IFU/mL140X108IFU/mL 第1次+++第2次+++第3次+++第4次+++第5次+++
23特异度试验结果3种试剂盒在检测3种特异度干扰标本时均为阴性结果％见表4%
表4特异度比对试验结果
标本试剂盒A试剂盒B试剂盒C 人胚肺成纤维细胞MRC-5———
非洲绿猴肾细胞系BGMK———
标准菌株ATCC25922大肠埃希菌一一一
3讨论
沙眼衣原体感染引起的性传播疾病在许多国家已跃居性传播疾病首位，在美国成为最常见性传播疾病,2015年上报病例数超过1500000例％欧洲筛查的无症状妇女沙眼衣原体感染的患病率为1.7%〜17.0%®'%我国性病流行以前以梅毒和淋病为主，近几年来，非淋球菌性尿道炎/宫颈炎的病例数已超过了淋病和梅毒，位居第1位％我国报道沙眼衣原体感染率为2.2%〜10.0%，女性患病率更高&12'%目前核酸扩增法(CT NAATs)因其灵敏度和特异度均很好，常作为诊断沙眼衣原体感染的方法&13'%但许多实验室不具备开展分子生物学检测条件，需要进行快速初筛时，采用最多的是胶体金免疫层析法％有文献报道POCT的成本效益比核酸扩增法更优，对公众健康的益处更大[78]%目前，国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的沙眼衣原体抗原检测试剂盒共有11个品种，质量参差不齐，POCT沙眼衣原体检测试剂盒存在灵敏度低的问题，从中到质量好(灵敏度及特异度均高)且价格合理的试剂盒非常重要％
目前，国内从事沙眼衣原体筛查的实验室很少具备培养沙眼衣原体的条件，对试剂盒的评估手段有限，选择试剂盒较为盲目％本文评价方法简单有效，本实验结果可作为实验室选择试剂盒的参考依据％沙眼衣原体体可分为很多血清型，其中沙眼衣原体A、B、Ba、C血清型可引起沙眼，D〜K血清
型可引起泌尿生殖道感染[1416]%国内沙眼衣原体血清型D 和E是泌尿生殖道感染中较常见的血清型，国内上市的免疫层析法(包括POCT)快速检测沙眼衣原体试剂盒，临床主要用于男女生殖道沙眼衣原体感染的检测％本实验室保存了来自英国南安普顿大学微生物系的沙眼衣原体血清型D(D/IC-Cal-S/ON)和血清型E(E/DK20/ON)，因此，选择血清型D和E进行本次实验%
通常灵敏度和特异度是使用和评价试剂盒的重
要参数％人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系来自14周龄男性胎儿的正常肺组织，系人源细胞系％当采集生殖道标本用于沙眼衣原体快速检测时，标本中会含有数量不等的人源上皮细胞，因此，有必要验证试剂盒是否对高浓度人源细胞裂解物存在交叉反应％非洲绿猴肾细胞系从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来，常用于沙眼衣原体的培养，采用非洲绿猴肾细胞系作为干扰物是验证用于培养的组织细胞成分是否对试剂盒检测有干扰％大肠埃希菌为引起泌尿生殖道感染最常见病原菌，约75%的尿路感染由大肠埃希菌引起，选择大肠埃希菌作为干扰物来验证试剂盒是否受到其他泌尿生殖道常见病原体的干扰％在特异度方面，本次试验结果显示，3种试剂盒均能够抗人胚肺成纤维细胞MRC5(2.9X106/mL)，非洲绿猴肾细胞系BGMK(浓度为5.0X106/mL)和标准菌株ATCC25922大肠埃希菌(1.5X108CFU/mL)的干扰。在重复性方面，3种试剂盒也无差异。灵敏度方面，笔者确定了3种不同厂家的商品POCT试剂盒在检测沙眼衣原体时的真实检出限，即绝对浓度，以IFU/mL表示，反应试剂盒的真实灵敏度，为本实验室及其他医疗机构实验室选择检测试剂盒提供参考％本次实验结果中，3
种试剂盒均未达到非常理想的水平％对于沙眼衣原体血清型D的检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到1.86X107IFU/mL，结果观察试剂盒B较试剂盒C阳性略明显(条带颜更深)，试剂盒B在1.86X106IFU/mL隐约可见条带，但试剂盒C 在1.86X106IFU/mL无阳性迹象；试剂盒A仅检测到1.86X109IFU/mL，且条带颜较另外2种试剂盒弱％对于沙眼衣原体血清型E检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到2.8X107IFU/mL，但均为弱阳性；试剂盒A仅能检测到2.8X109IFU/mL，且条带颜较另外2种试剂盒弱％综上所述，本研究显示检测检出限方面，试剂盒B和试剂盒C明显优于试剂盒A，试剂盒B略优于试剂盒C。
一般医疗机构实验室评估沙眼衣原体PCCT试剂盒的手段有限，选择试剂盒较为盲目，本研究采用保存的沙眼衣原体株确定了3种不同厂家的商品POCT试剂盒在检测沙眼衣原体时的真实检出限，即绝对浓度，反应了试剂盒的真实灵敏度，并且采用可能相关干扰物进行特异度评价，方法科学简单有效，为其他医疗机构实验室选择检测试剂盒提供具体可靠的参考依据％
参考文献
[1]VODSTRCIL L A,MCIVER R，HUSTON W M,et al.
The epidemiology of Chlamydia trachomatis organism
load during genital infection!systematic review[j].J In-
fectDisea2015211(10)1628-1645
&]GEISLER W M,UNIYAL A,LEE JY,et l Azithromycin versus doxycycline for urogenital Chlamydia trachom
atis infection[J]N Engl J Med，2015,373(26)：2512-
2521
[3]WIESENFELD H C.Screening for Chlamydia trachomatis
infections in women]J]N Engl J Med,2017,376(8)：765-
773
&]PANATTO D,AMICIZIA D,BIANCHI S,et al.Chlamydia trachomatis prevalence and chlamydial/HPV co-infection a
mong HPV-unvaccinatedyoungItalianfemales withnormal
cytology[J].Hum Vaccin Immunother,2015,11(1)：270-
276
&]HUNTINGTON S E,BURNS R M,HARDING-ESCH
关于加强和改进机动车检验工作的意见E etal Mode l ing-basedevaluationofthecosts$benefits
and cost-e f ectiveness of multipathogen point-of-care
testsforsexua l ytransmi t edinfectionsinsymptomatic
genitourinary medicineclinica t endees[J]BMJ Open$ 201889)：e020394
[6]KELLY H$COLTART CE M$PANT PAI N etal Sys-
tematicreviewsofpoint-of-caretestsforthediagnosisof urogenital Chlamydia trachomatis infections[J]Sex TransmInfect201793(S4)：S22-S30
[7]WIDDICE L E$HSIEH Y H$SILVER B etal Perform-
anceoftheatlasgeneticsrapidtestforChlamydiatracho-
matis and women's attitudes toward point-of-care testing
[J]SexTransm Dis201845(11)：723-727
&]STEPHEN S,MUCHANETA-KUBARA C G E,MUN-JOMA M W,et al Evaluation of cortez one step
chlamydia rapicard insta test for the detection of Chlamydiatrachomatisinpregnantwomenatmbarepoly-
clinicinharare$zimbabwe[J]IntJ MCH AIDS$2017$6
(1)19-26
[9]NI A P,LIN G Y,YANG L,et al A seroepidemiologic
studyof Chlamydia pneumoniae$Chlamydiatrachomatis
andChlamydiapsi t aciindi f erentpopulationsonthema-
刘震云单位
inlandofChina[J]ScandJInfectDis199628(6)：553-
557
王学左派
&0]倪安平，沈浣，何海英•生殖道沙眼衣原体细胞培养和血清学研究中华皮肤科杂志2000,33(3)162164. [11]JORGENSEN J H,PFALLER M A.Manual of clinical
microbiology[M]11thed Washington DC：ASM Press$ 201512-18
[12]ZHANG D,LI T,CHEN L,et l Epidemiological investi-
gationoftherelationshipbetweencommonlowergenital
tractinfectionsandhigh-riskhumanpapi l omavirusinfec-
北京击剑俱乐部tionsamong women in Beijing$China[J]PLoS One$ 201712：e0178033
[13]GEISLER W M.Diagnosis and management of uncompii-
catedChlamydiatrachomatisinfectionsinadolescentsand
adults : summary of evidence reviewed for the 2015 cen ters for disease control and prevention sexually transmit
ted diseases treatment guidelines [J ]. Clin Infect Dis ,
2015,61 (Suppl 8)： S774-S784.
[14] EDER T,KOBUS S,STALLMANN S,et l Genome se
quencing of Chlamydia trachomatis serovars E and F re
veals substantial genetic variation[J]. Pathog Dis, 2017, 759):2893-2899
[15] VERWEJ S P,LANJOUW E,BAX CJ,et l Serovar D
andEofserogroupBinducehighestserologicalresponses
管理•教学
in urogenital Chlamydia trachomatis infections [J]. BMC
InfectDis ,2014,14(1):3
[16] RAFFAI T, BURI A N K J ANOVAK L,et l Vaginal gel
componenthydroxyethylce l ulosesignificantlyenhances
theinfectivityofChlamydiatrachomatisserovarsDandE [J ] Antimicrob Agents Chemother ,2018,63(1):e02034-
18
(收稿日期：2019-01-26 修回日期：2019-04-04)
基于人才创新能力培养的TBCL 结合EBLM 思维教学模式在
医学检验教学中的探索*
*
基金项目：湖南省教育科学研究工作者协会2018年度立项课题（XJKX18B289）；长沙医学院教改课题（长医教：2017]44号44项）#
通信作者，E-mail ：1273088185@qq. com 。
本文引用格式：李敏，李大兴，熊一功，等•基于人才创新能力培养的TBCL 结合EBLM 思维教学模式在医学检验教学中的探索:J ].国际
检验医学杂志，2019,40（13）：1651-1655.
李 敏1，李大兴"，熊一功1，张徐倩1，杨晨钰1，王洪瑛1，郭先凤
（1.长沙医学院医学检验系，湖南长沙410219#.娄底中医院，湖南娄底417100）
摘 要：目的 探讨以复合任务为基础的团队合作学习（TBCL ）结合循证检验医学（EBLM ）思维教学模式
在医学检验教学中的作用，革新传统教学模式，促进创新人才培养，提高医学检验的教学质量，提升学生的学习
水平和综合素质&方法 以长沙医学院2015级医学检验专业本科班为研究对象，两个班共205人，随机选取1
班102人为实验教改班，采用TBCL 与EBLM 思维教学模式授课，2班103人为普通教学对照班，采用传统教 学模式授课&通过考试成绩、学习成果、问卷调查以及座谈会的形式对实验教改班进行教学效果的评价&结果
班级基本情况：实验教改班经过3年的TBCL 结合EBLM 思维教学模式的教学，在英语四级一次通过率
、英 语四级总通过率、英语六级通过率、计算机二级一次通过率、计算机二级总通过率、主持校级大学生创新创业课
题、主持省级大学生创新创业课题、主持国家级大学生创新创业课题、参加社会调查人数、发表文章篇数、发表 核心期刊文章篇数方面，与普通教学对照班比较，差异有统计学意义（P <0. 05）。考试成绩：入校期间对检验新
生进行摸底考试，两个班的学生平均成绩、优秀率、及格率等指标比较，差异无统计学意义（P >0. 05）。实验教 改班大一总成绩、学生平均成绩与普通教学对照班比较，差异无统计学意义（P >0. 05），但是优秀率、及格率比
较，差异有统计学意义（P <0. 05）。大二、大三在实验教改班和普通教学对照班总成绩、学生平均成绩比较，差 异有统计学意义（P <0.01），同时发现实验教改班3年来学生在平均成绩、优秀率、及格率等指标上，与普通教
学对照班比较，差异有统计学意义（P <0. 01）。调查问卷以及座谈会：实验教改班的学生每学年对教学效果以
及能力提高方面的认知，第一年收效不明显，但是随着入学时间的增长，在大二尤其是大三随着学习的深入，对
于教学效果和能力提高的认知更加彻底&结论在医学检验专业教学中，TBCL 结合EBLM 思维教学模式相 对于传统教学模式具有比较明显的优势，能更好地促进创新人才的培养、提高学生的学习水平和综合素质&
关键词：以复合任务为基础的团队合作学习；循证检验医学；医学检验专业；教学模式；教学效果
DOI 10. 3969/j. issn. 16734130. 2019. 13. 031
中图法分类号：R4,G4
文章编号：16734130（2019）13165105 文献标识码:B
目前，我国的医学检验专业教育仍以传统教学方 式为主，采用相对固定的培养模式，以培养纯知识型 为主的大学生为目标％但是随着社会的发展，渐渐发
现此培养目标下的学生在今后的工作中创新能力不 够突出％医学检验专业是介于基础医学和临床医学之
间的交叉学科，理论性和实践性都有极高的要求，这 就要求学生除了要有专业知识以外，还需要有判断能
力、分析能力、动手能力和创新能力[1]。以复合任务
豫公网安备41160202000603
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