TiO2法磷酸化富集
试验:pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响
共5个样品,各400ug蛋白(酶解之前),每个样品用1mg TiO2, 共用5mg。 流程:
数字通信世界1.TiO2 Beads 活化
向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2,震荡20min,8200×g,2min,离心,弃上清; 更换 wash buffer 1 1000ul,第一遍摇晃两次,弃上清;第二遍,震荡20min, 弃上清;
更换 Loading buffer 1000ul,2遍震荡30min,最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。
2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化,使TFA终浓度为0.1%—0.5%,离心浓缩抽干,之后重新用Loading buffer溶解(体积控制在400ul左右)。
3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集,将1mg TiO2 加入到一个样品中,室温旋转 30min,转速1100转/分。
4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中,8200×g党史博览
,2min,收集为Flow Through。 5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1,8200×g,2min,,重复3次,收集600ul。
6.p4电源再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2,8200×g,2min,,重复3次,收集600ul。
4、5、6合并到一起,为Flow Through。
7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1,8200×g,2min,,重复2次,收集400ul,为elute1;再加入200ul Elute buffer 2,8200×g,2min,收集200ul,为elute 2;合并elute 1和elute 2,总共600ul磷酸化多肽。
8.离心浓缩干,复溶于0.1% FA中,上样。
试剂准备:
试剂 | 1个样品所需体积 | 5个样品所需体积 |
Loading buffer | 1.4mL | 6mL |
中国酒文化论文wash buffer 1 | 1.6mL | 8mL |
wash buffer 2 | 0.6mL | 3mL |
Elute buffer 1 | 0.4mL | 2mL |
Elute buffer 2 | 0.7mL | 3.5mL |
西村工人体育场 | | |
Loading buffer:35%乙醇酸溶液/65%ACN/2%TFA
—3.5mL饱和谷氨酸溶液/乙醇酸
—6.5mL ACN
—0.2mL TFA
wash buffer 1:65% ACN/0.5% TFA
wash buffer 2: 65% ACN/0.5% TFA
Elute buffer 1:300mM氨水/50% ACN
—H2O 19.1mL
—ACN 20mL
—浓氨水(25%) 0.9mL
Elute buffer 2:500mM氨水/60% ACN
钱莹微博
—H2O 14.4mL
—ACN 24mL
—浓氨水(25%) 1.6mL