第47卷第1期2021年1月
吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.47No.1
Jan.2021
DOI：10.13481/j.1671⁃587Ⅹ．20210117
五倍子酸通过调节人肝癌HepG-2细胞线粒体氧化磷酸化 张海英1，张文馨*，赵文静2，李伟1
（1.吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室，吉林长春130021；2.吉林省肝胆病医院
中心实验室，吉林长春130062）
［摘要］目的
目的：观察五倍子酸（GA）对人肝癌HepG-2细胞生长的抑制作用，并阐明其作用机制。
方法：选择人肝癌HepG-2细胞，采用不同浓度（0，3.125、6.250、12.500、25.000、50.000和100.000mg·L－1）GA处理HepG-2细胞，分别作为对照组和3.125、6.250、12.500、25.000、
50.000及100.000mg·L－1GA组，采用MTT法检测各组细胞存活率。HepG-2细胞分为对照组及 6.25，12.50，25.00mg·L－1GA组，采用能量代谢分析仪检测线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）动态
全过程，流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位（MMP），比法检测各组细胞中三磷酸腺苷（ATP）水平，Western blotting法检测各组细胞胞浆和线粒体中细胞素C（Cyt C）蛋白表达量，吖啶橙染观察各组细胞形态表现，AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率。
结果：与对照组比较，不同浓度GA组细胞存活率明显降低（P<0.05）。与对照组比较，6.25、
12.50和25.00mg·L－1GA组细胞基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力和ATP产生
量均明显降低（P<0.05），细胞中MMP和ATP水平均明显降低（P<0.05），细胞胞浆中Cyt C蛋白表
达量增加，线粒体中Cyt C蛋白表达量降低，吖啶橙染可见细胞体积缩小、细胞核碎裂和染质凝集，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率明显升高（P<0.05）。结论
结论：GA可以抑制HepG-2细胞增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与GA降低MMP和抑制线粒体OXPHOS功能有关。
［关键词］五倍子酸；肝肿瘤；细胞凋亡；能量代谢；线粒体氧化磷酸化
［中图分类号］R285.5;R735.7［文献标志码］A
Induction effect of gallic acid on apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG-2cells through regulating
mitochondrial oxidative phosphorylation
ZHANG Haiying1,ZHANG Wenxin1,2,ZHAO Wenjing2,LI Wei1
（1.Key Laboratory of Pathology，Ministry of Education，Jilin University，Changchun130021，China；
楚雄师范学院学报2.Central Laboratory，Hepatobiliary Disease Hospital of Jilin Province，Changchun130062，China）
ABSTRACT Objective：To observe the inhibitory effect of gallic acid（GA）on the growth of human hepatocellular carcinoma HepG-2cells，and to elucidate its mechanism.Method：The human hepatocellular carcinoma HepG-2cells were selected and treated with different concentrations（0，3.125，6.250，[文章编号]1671⁃587Ⅹ(2021)01⁃0125⁃08
[收稿日期]2020⁃03⁃31
[基金项目]吉林省科技厅科技发展计划自然科学基金项目（20170623093-06TC）
[作者简介]张海英（1975－），女，吉林省舒兰市人，工程师，医学博士，主要从事小分子化合物抗肿瘤方面的研究。[通信作者]赵文静，主任技师（E-mail：xingyuewj@163）；
李伟，教授，硕士研究生导师（E-mail：*****************）
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第47卷第1期2021年1月
吉林大学学报（医学版）
12.500，25.000，50.000，and100.000mg·L－1）of GA and used as control group and3.125，6.250，12.500，25.000，50.000，and100.000mg·L－1GA groups，respectively.The survival rates of cells in various groups were detected by MTT assay.The HepG2cells were divided into control group and6.25，12.50，and25.00mg·L－1GA groups.The mitochondrial oxidative phosphorylation（OXPHOS）of Hep-G2cells was analyzed using energy metabolism analyzer.Flow cytometry was used to detect the mitochondrial membrane potential（MMP）of the cells in various groups.Colorimetry was used to detect the adenosine triphosphate（ATP）levels in the cells in various groups.The expression amounts of cytochrome C（Cyt C）protein in cytoplasm and mitochondria in various groups were detected by Western blotting method.The morphology of cells was measured by acridine orange staining，and AnnexinⅤ-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the cells in various groups.Results：Compared with control group，the survival rates of HepG2cells in different concentrations of GA groups were significantly decreased（P<0.05）.Compared with control group，the basal respiration，maximum respiration capacities，respiration reserve capacities and ATP levels in6.25，12.50，and25.00mg·L－1GA groups were significantly decreased（P<0.05）；the MMP and ATP levels in the cells were significa
ntly reduced（P<0.05）；the expression amounts of Cyt C protein in the cytoplasm were increased，and the expression amounts of Cyt C protein in mitochondria were decreased；the cells in GA groups were shrank，the nuclei were shattered，and chromatin was aggregated；the early apoptotic rates and late apoptotic rates were increased significantly（P<0.05）.Conclusion：GA can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of Hep-G2cells，and its mechanism may be related to reducing MMP and inhibiting mitochondria OXPHOS.
KEYWORDS gallic acid；liver neoplasms；apoptosis；energy metabolism；mitochondrial oxidative phosphorylation
哺乳动物细胞可通过线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）和糖酵解2种糖代谢方式供应能量ATP，常氧情况下，正常细胞糖代谢主要由线粒体OXPHOS产生ATP以提供代谢活动所需要的能量。WARBURG等［1］认为：肿瘤细胞由于线粒体呼吸缺陷，即使在有氧环境中也通过糖酵解供应大部分ATP。但近期研究［2-4］表明：多数肿瘤细胞线粒体是完整的，即使有些细胞具有更高的糖酵解，但仍保持线粒体呼吸，在某些癌症（包括白血病、淋巴瘤、胰腺导管腺癌、高OXPHOS亚型黑素瘤、子宫内膜癌和高侵袭性肿瘤等）中线粒体OXPHOS发挥重要作用，OXPHOS是抗肿瘤的新靶点。五倍子酸（3，4，5-三羟基苯甲酸，gallic acid，GA）也称为没食子酸或棓酸，是一种天然多酚类化合物，已证实其对多种肿瘤细胞系具有抗肿瘤活性［5-8］。但GA对肝癌细胞线粒
体OXPHOS的抑制作用尚未见报道。本研究以人肝癌HepG-2细胞为模型，首次采用Seahorse Extracellular Analyzer细胞能量代谢分析仪检测GA作用下HepG-2细胞量代谢动态全过程，分析细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）、线粒体细胞素C （cytochrome C，CytC）和细胞中ATP水平的变化，从细胞能量代谢和与之密切相关的细胞器线粒体出发，探讨GA抗肝癌的作用机制。
1材料与方法
头版头条
1.1细胞、主要试剂和仪器人肝癌HepG-2细胞（江苏凯基生物技术股份有限公司），GA（美国Chromadex公司），线粒体膜电位检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、线粒体分离试剂盒和胞浆蛋白抽提试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司），CytC单克隆抗体和β-actin抗体（美国SAB公司），化学发光检测试剂盒（上海天能科技有限公司），胎牛血清和DMEM培养基（美国Gibco公司），线粒体压力检测试剂盒（美国Seahorse Bioscience公司），ATP检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），全波长多功能酶标仪（美国Perkinelmer公司），高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），电泳仪和半干转印槽转膜仪（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（美国BD公司）。 126
张海英，等.五倍子酸通过调节人肝癌HepG⁃2细胞线粒体氧化磷酸化对细胞凋亡的诱导作用
1.2MTT法检测HepG-2细胞存活率参照文献［9］方法，HepG-2细胞以每孔100μL（1×105mL－1）接种到96孔细胞培养板，培养24h后分为对照组和不同浓度GA组（加入终浓度0、3.125、6.250、1
2.500、25.000、50.000和100.000mg·L－1GA［10］），每个浓度设置4个复孔，作用24、48和72h后，每孔加入20μL MTT 溶液，孵育4h后终止培养弃去培养液，每孔加入150μL DMSO充分溶解紫结晶物，酶标仪490nm下测定吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=（实验组A值－空白对照组A值）/（对照组A值－空白对照组A值）×100%。
1.3能量代谢分析仪检测细胞线粒OXPHOS水平对数生长期HepG-2细胞接种于Seahorse XFp 专用板（8000个/孔），培养24h后，分为对照组及6.25、1
2.50和25.00mg·L－1GA组，分别加入含0、6.25、12.50和25.00mg·L－1GA的
DMEM培养基作用24h，更换能量分析专用培养液，按照线粒体压力测定试剂盒说明书配制试剂，能量代谢分析仪实时检测细胞线粒体耗氧率（oxygen consumption rate，OCR），代表细胞线粒体OXPHOS活性，并根据OCR值分析各组HepG-2细胞的基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力和ATP产生量。
1.4流式细胞术检测细胞MMP每孔1×106个HepG-2细胞接种于6孔细胞培养板，培养24h后分组同“1.3”，分别加入含（0、6.25、1
2.50和25.0mg·L－1）GA的DMEM培养基作用12h，收集各组细胞按照Rhodamine123染试剂盒操作，激发波长505nm，发射波长530nm，流式细胞仪测定线粒体内Rhodamine123的荧光强度，以强荧光细胞百分率表示MMP。
1.5比法检测细胞中ATP水平细胞分组及处理同“1.4”，离心收集各组细胞，加入提取液，冰浴超声波破碎5min，4℃、12000r·min－1离心3min，取上清，置冰上检测。严格按照ATP水平测定试剂盒操作，分光光度计在波长636nm处测定各管A值。ATP水平（μmol·g－1prot）=（测定A值－对照A值）/（标准A值－空白A值）×标准品浓度（1×103μmol·L－1）×样本测定前稀释倍数/待测样本蛋白浓度（g·L－1）。
老爸老妈来欢唱1.6Western blotting法检测细胞胞浆和线粒体中CytC蛋白表达量细胞分组同“1.4”，收集GA
处理48h的HepG-2细胞，按照线粒体分离试剂盒操作制备线粒体裂解液，按照细胞胞浆蛋白抽提试剂盒操作制备胞质部分裂解液，BCA法测定蛋白浓度。取20μg蛋白样品上样，经SDS-PAGE电泳分离后，半干转蛋白至硝酸纤维素膜（NC）上，5%脱脂奶粉室温封闭3h，一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，ECL试剂进行化学发光。胶片于暗室曝光后，扫描并观察结果。
1.7吖啶橙染观察细胞形态表现细胞分组同“1.4”，收集GA处理48h的HepG-2细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×107mL－1，95μL细胞悬液加入5μL吖啶橙储存液（0.1g·L－1），染15min后取1滴细胞悬液点于洁净玻片上，盖玻片封片，荧光显微镜下观察细胞形态表现。
1.8流式细胞术检测细胞凋亡率每孔1×106个HepG-2细胞接种于6孔细胞培养板，24h后分为对照组及6.25、1
2.50和25.00mg·L－1组，更换含GA0、6.25、12.50和25.00mg·L－1GA的DMEM培养基作用48h，离心收集细胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。每个样品加入5μL Annexin V溶液和5μL PI溶液避光孵育15min，最后各加入400μL PBS 缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡。早期细胞凋亡率=早期凋亡细胞数/总细胞数×100%，晚期细胞凋亡率=晚期凋亡细胞数/总细胞数×100%。
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anycasting1.9统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。各组HepG-2细胞存活率、基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力、ATP产生量、MMP和ATP水平以及细胞凋亡率均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组HepG-2细胞存活率对照组HepG-2细胞生长活跃，经不同浓度GA处理24、48和72h 后，各剂量GA组HepG-2细胞存活率均不同程度降低（P<0.05或P<0.01），并呈明显的时间和浓度依赖性。见图1。
2.2各组HepG-2细胞线粒体OXPHOS与对照组比较，不同浓度GA组HepG-2细胞基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力和
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吉林大学学报（医学版）ATP 产生量均明显降低（P <0.05或P <0.01）。见图2
。
*
P <0.05，**
P <0.01compared with control group.
图1
GA 作用不同时间各组HepG -2细胞存活率
Fig.1
Survival rates of HepG -2cells in various groups after treated with GA for different
time
*
P <0.05，**
P <0.01compared with control group.A ：Curves of HepG -2cells in mitochondrial stress test ；B ：Basal respiration and spare
respiratory capacity of HepG -2cells ；C ：Maximal respiration of HepG -2cells ；D ：ATP production amount of HepG -2cells.
图2
各组HepG -2细胞线粒体OXPHOS
Fig.2
Mitochondrial OXPHOS of HepG -2cells in various groups
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张海英，等.五倍子酸通过调节人肝癌HepG⁃2细胞线粒体氧化磷酸化对细胞凋亡的诱导作用
2.3各组HepG -2细胞MMP 和ATP 水平GA 作
用24h ，HepG -2细胞中强荧光细胞百分率逐渐减少。6.25、12.50和25.00mg ·L －1GA 组强荧光细胞百分率即MMP 分别为（73.12±4.61）%、（65.49±4.32）%和（38.64±5.93）%，与对照组［（94.38±2.18）%］比较均明显降低（P <
0.05），见图3。与对照组比较，不同浓度GA 组细胞中ATP 水平均明显降低（P <0.05或P <0.01），6.25、12.50和25.00mg ·L －1GA 组细
胞中ATP 水平分别降低至61.11%、45.56%和
30.24%，见图4。
2.4各组HepG -2细胞胞浆和线粒体中Cyt C 表达量
对照组HepG -2细胞胞浆无Cyt C 特异条带，
不同浓度GA 组细胞胞浆均检测到Cyt C 表达，随着GA 浓度的增加胞浆中Cyt C 表达量明显增加；各组细胞线粒体均有Cyt C 特异条带出现，不同浓度GA 组线粒体中Cyt C 表达量随着GA 剂量的增加呈降低趋势。见图5。2.5
各组HepG -2细胞凋亡形态表现及凋亡率对照组HepG -2细胞形态饱满，细胞质呈均匀弥散绿荧光，细胞核形态规则；GA 处理48h 后不同浓度GA 组HepG -2细胞体积缩小，细胞核碎裂，染质凝集，呈凋亡细胞的形态学变化（图6）。
进一步采用Annexin V -FITC/PI 双染定量检测细胞凋亡率，GA 作用48h 后，6.25、12.50和25.00mg ·L －1GA 组早期细胞凋亡率分别为（10.8±0.8）%、（18.7±0.7）%和
（26.9±
0.8）%，与对照组［（0.2±0.1）%］比较明显升高（P <0.05）；晚期细胞凋亡率分别为（1.8±0.4）%、（11.2±0.6）%和（20.1±0.5）%，与对照组［（0.3±0.1）%］比较明显升高（P <0.05）。见图7
。
A ：Control group ；
B ：6.25mg·L －1GA group ；
C ：12.50mg·L －1GA group ；
D ：25.00mg·L －1GA group.
图3
各组HepG -2细胞MMP
Fig.3
MMP of HepG -2cells in various
groups
*
P <0.05，**
P <0.01compared with control group.
图4
各组HepG -2细胞ATP 水平
Fig.4Levels of ATP in HepG -2cells in various
groups
Lane 1：Control group ；Lane 2：6.25mg ·L －1GA group ；
Lane 3：12.50mg·L －1GA group ；Lane 4：25.00mg·L －1GA group.
图5各组HepG -2细胞胞浆和线粒体中Cyt C 蛋白表达电泳图
Fig.5
窄带滤波器Electrophoregram of expressions of Cyt C
protein in cytoplasm and mitochondria of HepG -2cells in various groups
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