有丝分裂指数的可靠指标
邸菁1
张凌志2
柏树令1
*
(11中国医科大学基础医学院人体解剖学教研室，沈阳 110001;21中国医科大学附属盛京医院急诊科，沈阳 110004)
[摘要] 目的 采用磷酸化组蛋白H3鉴定心肌细胞有丝分裂，为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础。 方法 对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞进行培养，利用免疫荧光双重染技术，用横纹肌肌动蛋白IgM 单克隆抗体标记心肌细胞，用磷酸化组蛋白H3IgG 单克隆抗体标记有丝分裂的染体，同时用Hochest 33342 显示细胞核，荧光显微镜观察并摄片。 结果 心肌细胞胞质呈红荧光，有丝分裂的染体呈现不同形状的绿荧光，胞核为蓝。 结论 磷酸化组蛋白H3是观察和鉴别心肌细胞有丝分裂的可靠指标。
[关键词] H9c2(2-1)细胞；有丝分裂；指数；磷酸化组蛋白H3；横纹肌肌动蛋白；免疫荧光双重染；大鼠[中图分类号] R329128 [文献标志码] A [文章编号] 0529-1356(2008)02-272
PHOSPH -HISTONE H3)))AN APPROACH TO DETECT THE
MITOTIC INDEX OF CARDIOMYOCYTES
DI Jing 1,ZHANG Ling -zhi 2,BAI Shu -ling 1*
(1.De partment o f Anatomy,China Medic al Unive rsit y ,Shenyang 110001,China ;
2.Eme rge nc y de partment,Shengjing ,the Se cond A ffiliated Hospital ,China Medical Universit y ,Shenyang 110004,China)
[Abstract ] Objective Applying a reliable precise method to assess the mitotic index of cardi omyocytes,to disclose of disclosure the mechanism implicated in cardiomyocytes proliferation.Methods H9c2(2-1)cardiomyocytes were ori ginally developed from rat BD1X heart (AT
CC).These cells were cultured on coverslips.Double immunofluorescence staining with monoclonal antibodies (1:100)against phospho -histone H3and A -sarcomeric actin was performed on the cultured cells.Ant-i mouse IgG FITC was used as the secondary anti body for the H3P antibody,and ant-i mouse IgM Cy3was used as the secondary antibody for the A -sarcomeric actin.DNA was visualized with Hoches t 33342.All photographs were taken wi th an Olympus fluorescence microscope.Results The cytoplasm of cardiomyocytes appeared red,the mi totic chromosomes green with distinct shape,and Hochest 33342-stained nuclei blue.Conclusion Our method is the reliable and exact means to observe and assess cardiomyocytes mi tosis.
[Key words ] H9c2(2-1)cell;Mitotic;Index;Phospho -histone H3;A -Sarcomeric actin;Double immunofluorescence
staining;Rat
[收稿日期] 2007-04-02 [修回日期] 2007-04-23[基金项目] 辽宁省教育厅资助项目(051525)
[作者简介] 邸菁(1975))，女(汉族)，辽宁省沈阳市人，在读
博士研究生，讲师。
*通讯作者(To whom corres pondence should be addres sed)E -mail:baishuling@hot mail.c om Tel:(024)23256666-5295
传统观点认为，哺乳动物心肌细胞是终末分化
细胞，出生后不久即丧失分裂能力，永久的退出细胞周期，成年哺乳动物的心肌损伤完全由瘢痕组织修补。近几年来，随着心肌再生研究的进展，有人发现，在心肌组织中存在一种干细胞(cardiac ste m cells,C SCs)库，随时补充凋亡坏死的细胞，可分化成心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，在心肌梗死的病
灶周围这种细胞增殖分化明显增多[1]
。成熟心肌细
胞也可被诱导再分裂，有报道用MAPK 抑制剂可促
进成熟心肌细胞去分化，重新进入细胞周期[2]
。由此可见，传统的观点受到了严峻的挑战，而心肌细胞增殖机制的研究成为今后人们关注的热点。用一种灵敏可信的方法观察和鉴别有丝分裂各个时期的心肌细胞是目前亟待解决的问题。磷酸化组蛋
白H3(phosph -Histone H3,H3P)只出现于有丝分裂期的染体，静止期细胞不表达；横纹肌肌动蛋白(A -sarcomeric actin,A -SMA)只存在于横纹肌细胞胞质中，平滑肌等其他细胞不表达。我们采用双重免疫荧光染的方法使这两种蛋白在一个细胞中同时表达，这样就能清晰地将处于有丝分裂的心肌细胞与
#272 #第39卷 第2期
2008年4月
解 剖 学 报
AC TA ANATOM ICA SINICA
Vol 139,No 12
Apr.2008
乐果q7
天然气利用政策其他细胞区分开，有利于心肌细胞有丝分裂指数的确定，是研究心肌细胞增殖机制的有力工具。
材料和方法
11主要试剂
H3P小鼠I gG单克隆抗体为美国Cell Signaling 公司产品,FITC小鼠IgG为Santa Cruz公司进口分装,A-SMA小鼠Ig M单克隆抗体和Cy3-SABC小鼠I gM免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。DME M购自美国GIBCO公司。
21细胞系与细胞培养
H9c2(2-1)大鼠心肌细胞GNR5购自中国科学院细胞库(美国ATCC公司提供)，为第7代冻存细胞，源于B D1X大鼠胚胎心脏组织克隆细胞株的一个亚克隆。用10%FB S-DME M细胞培养液，置C O2培养箱(饱和湿度、95%空气-5%C O2、37e)进行培养，每3d换液1次。
31免疫荧光双重染
癌症旅馆
爬片后的H9c2(2-1)细胞用4%多聚甲醛固定30min,PBS洗10min,5%BSA-PB S液封闭1h，一抗(A-SMA小鼠IgM单克隆抗体1:100,H3P小鼠IgG单克隆抗体1:100)4e孵育过夜,PBS洗10min@3，二抗(C y3-SABC小鼠IgM1B100,FI TC小鼠IgG1B100)室温暗盒孵育2h,PB S洗10min@3,Hochest33342染5min，缓冲甘油封片。阴性对照不加一抗，其余步骤相同。Olympus荧光显微镜观察并摄片。
结果和讨论
吕冠成
11H9c2(2-1)细胞有丝分裂相的形态学观察在心肌细胞有丝分裂M期的全过程中都存在着核小体组蛋白H3的磷酸化，此时染体形态发生阶段性变化：前期，染质不断浓集，形成染体；中期，染体排列在赤道板上；后期，两条染单体向纺锤体的两极移动。我们用H3P特异性抗体结合FI TC标记的二抗，将处于M期的心肌细胞胞核染成绿，并可通过染体的形态清晰地分辨出不同的分裂时期(图1~10)。A-SMA位于胞质，由C y3染成红。胞核由Hochest33342染成蓝，同一视野3种不同颜的图片叠加以后可以看到处于有丝分裂M期的心肌细胞胞核为灰白，而其他细胞的胞核仍为蓝(图4,8~10)。
21本实验方法的应用价值探讨
一般认为，高度分化的哺乳动物细胞不能再增殖，这些细胞永久地退出细胞周期。细胞特异性的关键蛋白在细胞内积聚并使细胞形成最终形态和具备功能[1]。与哺乳动物相反，硬骨鱼和两栖动物的终末分化细胞可以去分化和(或)增殖，从而再生。例如，斑马鱼的心脏可以通过心肌细胞的增殖而再生[3]。因此，研究调节细胞周期退出机制，以及研究促进哺乳动物细胞增殖的方法，具有极大的应用价值。
许多研究指出，成年哺乳动物心肌细胞具有增殖能力，但是这些研究互相矛盾。早在1888年，就有研究描述了坏死心肌周围肌纤维有丝分裂图，这些发现已被其他研究者所证实[3]。然而，这些有丝分裂
现象是否定位于心肌细胞还不清楚，因此上述结论值得怀疑。这就促使研究者尝试各种方法检测心肌细胞有丝分裂或细胞分裂现象。通过皮下注射BrdU，一段时间后在心肌组织切片上采用BrdU免疫荧光检测，来判断心肌组织DNA合成率[4]。这种方法可以在一定程度上反映心肌细胞增殖情况，但是不能排除心肌细胞只合成DNA而未进行细胞分裂的可能。用免疫组织化学方法检测Ki67的表达也是反映细胞有丝分裂的常用指标，但是Ki67表达于所有进入细胞周期的细胞核，对于有丝分裂的分期不能很好区分，不利于计数有丝分裂指数[5]。
王子灿在诱导心肌细胞增殖的研究中，通过转基因小鼠或体外培养心肌细胞直接转染的方法，促进(如Cyclin A2等)或抑制基因(p38等)在心肌细胞中过表达，以探讨这些基因对心肌细胞增殖能力的影响，最常用也是最可靠的判断心肌细胞增殖的指标就是检测H3P的表达[2,4]。目前，国内尚未见到用H3P 检测心肌细胞有丝分裂的报道。我们通过免疫荧光染技术标记染体的H3P，在普通荧光显微镜下便能清晰地显示出染体的形态，从而区分细胞周期各个时期。免疫荧光染易出现假阳性和背景染，根据H3P和DNA胞内定位相同的特点，我们在标记H3P的同时做了Hochest33342的复染，以排除假阳性，同时在漂洗过程中使用高盐PBS，最大限度地减少背景非特异性染。总之，我们使横纹肌肌动蛋白与H3P共表达，可以准确地分辨心肌细胞有丝分裂，是判断心肌细胞增殖的可靠指标，为心肌细胞增殖机制的研究提供方法。
参考文献
[1]Beltrami AP,Barlucchi L,Torella D,et al.Adult cardiac s te m cells
pcchips
are multipotent and s upport myocardial regeneration[J].Cell,2003, 114(6):763-776.
[2]Engel FB,Schebes ta M,Duong MT,et al.P38MAP kinase i nhibi ti on
enables proliferation of adult mammalian cardi omyocytes[J].Genes Dev,2005,19(10):1175-1187.
[3]Chaudhry HW,Dashous h N H,Tang H,et al.Cyclin A2mediates
cardiomyocyte mi tosi s in the pos tmitotic myocardi um[J].J Bi ol Chem, 2004,279(34):35858-35866.
[4]Pasumarthi KB,Nakaji ma H,Nakaji ma HO,et al.Targeted expressi on
of cyclin D2results in cardiomyocyte DNA synthesi s and infarct regression in trans genic mice[J].Ci rc Res,2005,96(1):110-118. [5]Suz uki G,Lee TC,Falla volli ta J A,et al.Adenoviral gene trans fer of FGF-
5to hibernating myocardi um improves func ti on and s timulates myocytes to hype rtrophy and reenter the cel l cycle[J].Circ Res,2005,96(7):767-775.
Vol.39,No.2邸菁等.磷酸化组蛋白H3)))检测心肌细胞有丝分裂指数的可靠指标#273#
H9c2(2-1)细胞免疫荧光双重染@400图1 A -SMA 表达于H9c2(2-1)细胞的胞质，呈红荧光; 图2 H3P 表达于有丝分裂的胞核，呈绿荧光; 图3 全部胞核被Hochest 33342染成蓝; 图4 1~3图片的叠加，有丝分裂的胞核因蓝和绿荧光的叠加而成灰白; 图5~10 为局部放大图片,H3P 的表达显示出有丝分裂不同时期的染体形态，图5为前期，图6为中期，图7为后期; 图8~10 分别为图5~7的叠加图像(因篇幅所限A -SMA 图像和核染未呈现)。
Immunofluorescence double staining by H3P and A -SMA in H9c2(2-1)cells. @400Fi g.1 A -SMA located in cytoplas ma appears red;Fi g.2 H3P was stained for as an indicator of ac tive mitosis,and appears green;Fi g.3 Hoches t33342-s tained nuclei appear bl ue;Fig.4 After overlappi ng by Fi g.1-3,mitotic nuclei appears grey;Fig.5-10 Zoo m figures.Di stinct s hape of c hromosomes were s hown;Fig.5 prophas e;aphase;Fig.7.anaphase;Fig.8-10 Overlap figures for 5-7.
(编辑 安晓意)
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解 剖 学 报39卷,2期
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